鳖甲消癥丸对肝硬化门静脉高压症大鼠肝功能及血清NO、ET-1、VEGF 的影响

吴晓玲，李力强，吴伟斌，胡钰颖，杨 坚，祝晓忠，张贵锋*

（1.肇庆医学高等专科学校，广东 肇庆 526020；2.肇庆市中医院，广东 肇庆 526020）

门静脉高压症（portal hypertension，PHT）是由肝硬化等导致门静脉压力持久增高引起的症候群，采取有效措施降低门静脉压力对延缓静脉曲张进展、预防食管胃底静脉曲张破裂出血至关重要[1]。鳖甲消癥丸是一种能有效预防肝硬化食道胃底静脉曲张破裂出血中药院内制剂（粤药制字Z20070356，专利号ZL20150670167.3）[2]。为探索该药物的作用靶点及疗效机制，课题组观察了鳖甲消癥丸对肝硬化门静脉高压症大鼠的门静脉压力（PVP）、肝脏组织、血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、总胆红素（TBil）、一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、血管内皮生长因子及其受体2（VEGF/VEGFR2）等指标的影响，报道如下。

1 实验材料

SD 大鼠40 只，雌雄各半，适应性饲养1 周，随机分为空白对照组10 只、造模组30 只。造模成功后的大鼠24 只，随机分为模型对照组、普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组，每组8 只；空白对照组8 只入组观察。鳖甲消癥丸（批号20180702，肇庆市中医院制剂室生产），普萘洛尔片（批号B180905，江苏亚邦药业集团股份有限公司），高脂饲料，四氯化碳，AST、ALT、TP、ALB、TBil 检测试剂盒，总NO 检测试剂盒，ET-1/VEGF ELISA 试剂盒，蛋白浓度测定试剂盒，VEGFR2 和β-actin 抗体，HRP 标记的山羊抗兔二抗。

2 实验方法

2.1 动物造模 参考文献采用四氯化碳复合法诱导造模[3]：造模组大鼠给予高脂饲料加5%食用白酒溶液进行饲养，空白对照组用普通饲料及蒸馏水进行饲养。第1～2 周按20 mL/kg 体质量给予造模组40%（v/v）的四氯化碳橄榄油溶液灌胃，第3～12 周按20 mL/kg体质量给予造模组50%（v/v）的四氯化碳橄榄油溶液灌胃，每周一、周四各给药1 次。空白组给予等量橄榄油溶液。第12 周末，随机选择空白组、造模组大鼠各2只，对比空白组及造模组指标，确定造模是否成功。

2.2 干预方法 普萘洛尔组、鳖甲消癥组分别用普萘洛尔片、鳖甲消癥丸混悬液进行灌胃给药。普萘洛尔10 mg/kg，鳖甲消癥丸0.5 丸/kg。用小量温水将药物研磨为混悬液，加入适量温水配置为灌胃液，按照5 mL/kg 体质量进行灌胃。空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃。每日干预1 次，连续干预8 周。

2.3 体质量检测及症状观察 将大鼠置于1 L烧杯内，待大鼠安定后读取电子天平测量值，减去烧杯质量。每日观察记录1次大鼠的进食、毛发色泽、活动状态等。

2.4 标本采集及指标检测 门静脉压力检测，大鼠禁饮食8 h，乌拉坦麻醉后切开腹部暴露门静脉主干，用PE-50 导管穿刺门静脉主干，接通压力传感器及多通路记录仪，取3 次平均值。通过HE 染色及Masson 染色观察大鼠肝组织损伤情况及纤维化程度。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA），按照试剂盒说明书步骤，检测肝功能指标及血清NO、ET-1、VEGF。运用蛋白印迹法检测VEGFR2 蛋白表达水平。

2.5 统计学方法 数据采用均数±标准差（）表示，图像采用imageJ 进行半定量分析，运用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，组间比较采用one-ANOVA进行统计。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量结果的比较 模型对照组大鼠体质量显著高于空白对照组（P＜0.05）。模型对照组大鼠体质量升高到第4周开始逐渐下降，空白对照组、普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组体质量持续上升，普萘洛尔组的大鼠体质量升高最为显著。结果见图1。

图1 连续给药8 周各组大鼠体质量变化情况

3.2 各组大鼠门静脉压力结果的比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠门静脉压力显著增高（P＜0.01）。与模型对照组比较，普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组大鼠门静脉压力显著降低（P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠门静脉压力结果的比较（，n =8）

表1 各组大鼠门静脉压力结果的比较（，n =8）

注：与空白对照组比较，# P ＜ 0.05；与模型对照组比较，△P ＜ 0.05

3.3 各组大鼠肝组织病理切片结果的比较 HE 染色结果：空白对照组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞大小一致、核居中，未见脂肪变性，汇管区未见炎症细胞浸润及纤维组织增生。模型对照组大鼠肝组织可见大量宽厚纤维增生，形成大小不等假小叶，假小叶内肝细胞肝索结构模糊，部分细胞出现脂肪变性；汇管区大量纤维组织增生及淋巴细胞浸润。相比于模型对照组，普萘洛尔组及鳖甲消癥丸组大鼠肝组织隐约可见纤细的纤维组织增生及假小叶结构，汇管区有少量纤维组织增生及淋巴细胞浸润（图2）。Masson染色结果：空白对照组大鼠肝组织的纤维组织位于汇管区周边，未见分割肝小叶的纤维组织。模型对照组大鼠肝组织汇管区周边可见大量纤维组织增生，宽厚的纤维组织向周边肝组织延伸，将肝细胞包绕成大小不等的团块。与模型对照组比较，普萘洛尔组与鳖甲消癥丸组大鼠肝组织可见染成蓝色的纤维组织增生并形成假小叶，但纤维间隔明显变窄，汇管区纤维明显减少（图3）。

图2 各组大鼠肝组织病理切片HE 染色结果

图3 各组大鼠肝组织病理切片Masson 染色结果

3.4 各组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil 结果的比较 模型对照组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil与空白对照组比较，有显著差异（P＜0.01）。与模型对照组比较，普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组大鼠血清AST、ALT、TBil 显著降低（P＜0.01），TP、ALB显著升高（P＜0.01）。鳖甲消癥丸组大鼠血清AST、TP、ALB 与普萘洛尔组比较，无显著差异（P＞0.05），但ALT、TBil 有显著差异（P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil 结果的比较（，n =8）

表2 各组大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil 结果的比较（，n =8）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05；与普萘洛尔组比较，▲P ＜0.05

3.5 各组大鼠血清NO、ET-1、VEGF 结果的比较 模型对照组大鼠血清NO、ET-1、VEGF与空白对照组比较，有显著差异（P＜0.01）。与模型对照组比较，普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组大鼠血清NO、ET-1、VEGF 显著降低（P＜0.01）。鳖甲消癥丸组大鼠血清NO、ET-1、VEGF 与普萘洛尔组比较，无显著差异（P＞0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠血清NO、ET-1、VEGF 结果的比较（，n =8）

表3 各组大鼠血清NO、ET-1、VEGF 结果的比较（，n =8）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05

3.6 各组大鼠肝组织VEGFR2 表达量结果的比较 与空白组比较，模型组VEGFR2 表达显著升高（P＜0.01）；普萘洛尔、鳖甲消癥丸均能显著下调VEGFR2 的表达量（P＜0.01），前者作用更加显著，但都不能使其恢复到正常水平（P＜0.01）。结果见表4、图4。

图4 各组大鼠肝组织VEGFR2 表达量结果的比较

表4 各组大鼠肝组织VEGFR2 表达量半定量结果的比较（，n =8）

表4 各组大鼠肝组织VEGFR2 表达量半定量结果的比较（，n =8）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05；与普萘洛尔组比较，▲P ＜0.05

4 讨论

非选择性β 受体阻滞剂（nonselective beta blocker，NSBB）是肝硬化门静脉高压所致食管胃静脉曲张的一线药物、二级预防的首选药物，普萘洛尔属于传统的NSBB，是临床治疗肝硬化门静脉高压的常用药物，通过同时阻滞β1、β2 受体，降低心率及心输出量和使内脏血管舒张，从而降低门静脉压力[4]。但NSBB 并非适用于每一例静脉曲张的患者，约40%的患者服药后门脉压力无明显降低[5]，且有多中心随机对照研究显示，NSBB 不能阻止静脉曲张的形成[6]。随着临床研究的深入，许多学者认为单纯西药治疗肝硬化门静脉高压症存在局限性，而中医药可以发挥协同治疗作用，同时有效改善肝纤维化、降低门静脉压力、减少临床并发症等，从而预防食管胃底静脉曲张破裂出血[7]。

肝硬化门静脉高压症根据临床表现可归为中医“鼓胀”“胁痛”“积聚”“黄疸”等疾病范畴，中医认为肝硬化是因肝、脾、肾三脏功能失调，气滞、血瘀、水停瘀结腹中所致，属于本虚标实、虚实夹杂之证[8-9]。李力强教授根据本病的病因病机研制了中药复方鳖甲消癥丸，由醋鳖甲、醋三棱、醋莪术、人工麝香、西洋参、炙黄芪、醋白芍、炒白术、茯苓、生大黄、生甘草等组成；醋鳖甲入肝消积、软坚散结，麝香通窍活络、活血消癥，为君药；醋莪术与醋三棱活血行气、消癥止痛，为臣药；西洋参和炙黄芪补益气血、扶益正气，醋白芍柔肝止痛，炒白术和茯苓健脾益气、利水祛湿，共为佐药；生大黄活血化瘀、荡涤湿热，生甘草缓急止痛、调和诸药，共为使药。诸药合用，具有益气活血、化瘀消癥之功效，标本同治。二十余年的临床应用表明，鳖甲消癥丸对预防肝硬化门静脉高压食管胃静脉破裂出血、抗肝纤维化等有显著效果[10-11]，能明显改善患者肝区疼痛、黄疸、腹水、蜘珠痣、肝掌、舌边瘀斑、脾肿大等症状；显著降低门静脉压力和食管静脉压力，改善食管静脉曲张，预防食管胃静脉出血；改善肝纤维化，降低肝内血管和门体侧支血管阻力。

本研究结果显示，空白对照组大鼠肝组织结构正常，模型组大鼠肝组织出现大量的纤维增生，小叶结构破坏明显，形成大小不等的假小叶，部分细胞脂肪变性，汇管区可见明显结缔组织增生。模型组大鼠与空白对照组比较，门静脉压力显著增高，血清AST、ALT、TBil、NO、ET-1、VEGF 水平和VEGFR2 表达显著升高，TP、ALB 显著降低，这与既往多项研究结果一致[12-15]。经过8 周的干预治疗，鳖甲消癥丸组、普萘洛尔组肝组织中的假小叶结构、炎细胞浸润、细胞坏死程度都较模型组有显著改善，表明两个药物均可以有效改善肝硬化大鼠的肝纤维化。鳖甲消癥丸组的AST、TP、ALB 与普萘洛尔组无明显差异，但ALT、TBil 显著高于普萘洛尔组，说明普萘洛尔能更有效促进肝硬化门静脉高压大鼠肝功能的恢复。普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组大鼠AST、ALT、TBil 均显著低于模型对照组，TP、ALB 显著高于模型对照组，提示普萘洛尔、鳖甲消癥丸均能有效促进肝硬化门静脉高压大鼠肝功能的恢复。肝硬化门静脉高压症食管胃底静脉曲张发生率与肝功能损害的严重程度密切相关，鳖甲消癥丸能逆转肝硬化门静脉高压大鼠的肝功能，进一步证实了鳖甲消癥丸可预防肝硬化门静脉高压症食管胃底静脉曲张破裂出血。普萘洛尔组、鳖甲消癥丸组血清NO、ET-1、VEGF 无明显差异，但均显著低于模型对照组，表明普萘洛尔、鳖甲消癥丸对肝硬化门静脉高压大鼠血管内皮细胞相关指标有明显的调控作用，二者调控效果相当。NO 在肝硬化门静脉高压中形成中具有重要调控作用，肝硬化时NO 合成酶的活性降低，导致肝窦内皮细胞NO 产生减少，使星状细胞收缩性增强，从而导致肝内血管阻力增加，造成门静脉高压[16]。ET-1 具有强烈持久缩血管和促血管平滑肌细胞增殖作用，通过与肝内内皮素A 受体结合诱发肝窦内皮细胞和星状细胞收缩，导致肝内血流阻力增加和肝脏微循环障碍，最终导致门静脉高压[17-18]。VEGF 是强效的促血管通透性增强、促血管生成因子，可刺激血管内皮细胞分裂增生，形成新生血管和减少细胞凋亡，而在促血管再生过程中可导致血管通透性增高，引起液体渗出增加，加重腹水症状[19-20]。鳖甲消癥丸能显著降低肝硬化门静脉高压大鼠血清NO、ET-1、VEGF 水平，减少肝组织VEGFR2 的表达量，提示鳖甲消癥丸可能通过下调肝硬化门静脉高压大鼠血清NO、ET-1、VEGF/VEGFR2 等血管内皮相关因子释放及其受体的表达，达到减轻肝内血管阻力、增强肝脏微循环、降低肝内血管通透性的作用而发挥综合疗效。

综上所述，鳖甲消癥丸在受测剂量下对四氯化碳诱导大鼠肝硬化门静脉高压的治疗作用与普萘洛尔相当，能有效改善肝硬化门静脉高压大鼠肝功能、肝组织纤维化及下调门静脉压力，其机制可能与调控血清NO、ET-1、VEGF/VEGFR2 等血管内皮功能相关因子有关。