基于PI3K/AKT信号通路探究芍药甘草汤对神经根型颈椎病模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

白登彦，王 冠，张海军，朱 涛，赵志鹏，吕立桃

(1.甘肃省第二人民医院,甘肃 兰州 730099；2.西北民族大学附属医院,甘肃 兰州 730015；3.开封市人民医院骨一科，河南 开封475001)

神经根型颈椎病(Cervical spondylotic radiculopathy，CSR)是目前最常见颈椎疾病之一，其临床表现为颈部的神经性疼痛，伴随炎性反应，其发病主要由椎间盘退行性功能改变引起的分子生物学反应。研究发现[1]，炎症反应是引起CSR疼痛的主要原因。炎症反应与细胞内的信号转导通路相关，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/丝氧酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)是炎性反应的主要信号通路[2]。当AKT被PDK2磷酸化为p-AKT后，激活PKB/AKT，进而激活AKT通过磷酸化含有丝氨酸残基的底物Bax 和Bcl-2等因子，促进产生抗凋亡的分子生物学效应[3-5]。研究认为[6]，PI3K/AKT信号转导途径与脊神经细胞凋亡相关。其中Bax 和Bcl-2的含量变化与CSR发病存在密切关系。CSR在祖国医学中属于“项痹”，中医药在临床治疗CSR方面优势明显，芍药甘草汤出自张仲景所著的《伤寒杂病论》，研究[7]显示其治疗CSR的效果明显，但作用机制尚不明确。本研究通过建立CSR模型大鼠，并用芍药甘草汤浓缩液灌胃干预的方法，探究CSR模型大鼠在芍药甘草汤干预下PI3K/AKT信号通路的调控作用，并分析其对Bax及Bcl-2的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠90只，20周龄，体重(200±20)g，雌雄各半，购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物质量合格证号SCXK(甘)2020-0001。饲养于甘肃中医药大学实验动物中心，雌雄分开饲养，自由进食、饮水，适应性喂养1周后进行实验造模。

1.2 实验药品与仪器 芍药甘草汤方药购自甘肃中医药大学附属医院中药房，药物组成：白芍、甘草各15 g。3MA 试剂，购自通化茂祥制药有限公司，批号H20200112。Bax(批号：AC2020002)、Bcl-2(批号：E2020010)试剂盒，均购自上海信帆生物。兔抗大鼠PI3K抗体，购自武汉艾美捷科技有限公司，批号A50003)；兔抗大鼠AKT，购自武汉益普生物科技有限公司(批号：A30008)；山羊抗兔单抗，购自武汉艾美捷科技有限公司(批号：A21021)；BCA蛋白试剂盒，购自美国Thermo公司(批号：23220)。酶标仪(瑞士TECAN公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 动物分组与处理 按照随机数字法将90只大鼠分为空白组、模型组、对照组、芍药甘草汤治疗低、中、高剂量组共六组，每组15只。除空白组外，其余大鼠按照参考文献[8]制备CSR大鼠模型。俯卧位固定大鼠，颈部剃毛清洁后消毒，暴露脊椎，显微外科镊将消毒后的尼龙鱼线放置在C6-7～T1神经根下，缝合。各造模组大鼠1周后进行步态障碍评分评价造模情况。本实验中造模组大鼠均造模成功。造模后开始灌胃治疗，空白组大鼠及模型组大鼠给予生理盐水1 ml/只灌胃，对照组给予1 ml 3MA(15 mg/kg生理盐水稀释)灌胃，芍药甘草汤低、中、高剂量组大鼠分别按照剂量8、12、16 g/kg给予灌胃，1次/d，共持续14 d。

1.4 检测指标

1.4.1 大鼠步态评分测定：参照文献[9]步态方法评估大鼠造模情况。大鼠步态正常，左前肢无畸形，为1分；出现行走时跛行，左前肢足畸形内收蜷缩，轻微持重或不持重为2分；出现抬起、走动时不着台面，左前肢足显著内收蜷缩畸形，为3分。记录并评分。

1.4.2 样品取材：灌胃结束24 h后，按照7.5 μl/g乌拉坦麻醉处死大鼠，取颈部脊髓及神经根组织样品2份，1份置多聚甲醛固定，另1份-80 ℃冰箱中保存待检。

1.4.3 ELISA法检测组织中Bax和Bcl-2含量变化：按照ELISA试剂说明书操作步骤，检测各组大鼠组织中Bax和Bcl-2含量变化。

1.4.4 HE法检测组织病理学变化：将提取的组织固定后分别石蜡包埋和组织切片后进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观测各组大鼠组织病理学变化。

1.4.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PI3K、AKT蛋白表达：各组大鼠组织中分别加入RIPA裂解缓冲液，分别提取组织中的总蛋白，参照BCA蛋白试剂盒说明检测不同组大鼠脊髓组织中蛋白的含量。SDS-PAGE等量分离蛋白质，并于PDVF膜上4 ℃条件添加一抗孵育过夜。洗涤后添加二抗(1∶200)常温下进行2 h孵育。ECL试剂显影后应用软件Quantity One测定蛋白含量的相对表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件分析处理。计量资料数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠治疗前后步态积分比较 见表1。与空白组比较，模型组和各给药组大鼠在造模后步态积分均出现升高(P<0.05)，说明CSR模型造模成功。治疗14 d后，各给药组与同期模型组比较，步态积分均出现不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且随着芍药甘草汤剂量增加治疗效果更佳(P<0.01)。

表1 各组大鼠治疗前后步态积分比较(分)

2.2 各组大鼠组织病理学比较 空白组大鼠的组织细胞排列整齐，界限清晰，无炎症浸润；模型组大鼠组织细胞间隙错乱，出现炎性浸润；各药物组大鼠组织炎性变化逐渐改善(图1)。

2.3 各组大鼠组织中Bax及Bcl-2含量比较 见表2。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的Bax升高，Bcl-2含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各给药组Bax含量降低，Bcl-2含量升高(P<0.05)，且芍药甘草汤随剂量增加治疗效果更加明显(P<0.01)。

2.4 各组大鼠组织中PI3K、p-AKT蛋白表达比较 见表3。与空白组大鼠比较，模型组大鼠组织中PI3K、p-AKT蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各给药组PI3K、p-AKT蛋白含量表达升高(P<0.05)，且芍药甘草汤的治疗效果随剂量增加更加明显(P<0.01)，见图2。

表3 各组大鼠组织中PI3K、p-AKT蛋白表达比较

A：空白组；B：模型组；C：对照组；D：芍药甘草汤低剂量组；E：芍药甘草汤中剂量组；F：芍药甘草汤高剂量组

3 讨 论

CSR发病与体内炎性反应、代谢异常、细胞过度自噬凋亡相关[10]。祖国医学并无CSR病名的记载，可将CSR归属为“ 痿病”“痹证” “项强”等范畴，发病多与颈项部气血运行不利，而产生的颈部疼痛等表现，根本病因是血虚寒凝，治疗原则当温经活血、温阳通脉、散寒化湿[11]。芍药甘草汤始见于《伤寒杂病论》，方含白芍、甘草，是治疗疼痛的代表方。白芍味苦、酸，性微寒，既能养血和营，柔肝镇痛，平抑肝阳，又可养血调经，敛阴止汗。甘草补中益气，缓急止痛。现代药理研究结果显示[12]，白芍的主要成分为白芍总苷、山柰酚及β谷甾醇，能够调节免疫、改善线粒体功能，有修复受损的纤维环，减轻组织水肿压迫，发挥抗炎止痛的效果。甘草的主要活性成分为槲皮素、芒柄花素和甘草多糖等，能够清除活性氧自由基、激活白细胞介素、抑制神经炎性反应、提高免疫功能[13]。实验表明[14]，甘草的消炎疗效优于白芍，白芍的镇痛效果优于甘草，两药物按比例进行搭配，效果大于单一药物的功效，并且药物浓度越高，抗炎镇痛的疗效越好。

PI3K是细胞内特殊的磷脂酰肌醇激酶，具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性，G2可被受体酪氨酸激酶或蛋白耦联受体激活，再通过第二信使Bax和Bcl-2，在细胞的增殖、凋亡等过程中起重要的作用[15]。Bax和Bcl-2是 PI3K/AKT信号转导通路上的2个关键因子，他们同属Bcl-2家族，参与细胞凋亡的重要生物学因子。其中Bax是促细胞凋亡的因子，而Bcl-2属于抗细胞凋亡的因子。研究指出[16]，在线粒体的作用下，Bcl-2家族通过对线粒体的介导而对细胞凋亡过程起调控作用。Bax对细胞凋亡的调控可能通过诱发线粒体膜上供凋亡蛋白通过的离子通道开放和精确改变线粒体膜的通透性而释放CytC；而Bcl-2通过抑制Bax的表达，抑制细胞色素C与半胱氨酸蛋白酶激活而起到的抗凋亡作用。研究表明[17-19]，在免疫因子诱导的CSR发病过程中，固有免疫发挥着重要的作用。CSR发病时，组织内发生多种特异性免疫反应。有学者发现[17]，Bcl-2在CSR模型大鼠组织中的表达要高于未造模组。Bcl-2过度表达会影响细胞正常状态下基质的分解和合成动态代谢平衡，加速细胞分解代谢以及自噬凋亡过程，加速关节退变和炎症病变。

临床上芍药甘草汤对CSR治疗效果良好，但该方的具体作用机制并不清楚[20]。本次研究表明，在造模后大鼠步态障碍积分升高，组织病理学显示，造模后大鼠组织内炎性病变明显，提示CSR大鼠造模成功。经治疗，各治疗组CSR大鼠血清中Bax及Bcl-2含量出现变化，而空白组及模型组无明显变化；组织病理学结果也显示各治疗组脊髓神经根组织炎性病变减轻，这说明芍药甘草汤可能通过调节Bax及Bcl-2，抑制CSR大鼠机体免疫应答反应。

PI3K/AKT信号通路在正常关节组织和神经组织中活性较低，当组织出现特异性免疫反应时，信号通路中多种蛋白表达含量出现明显变化[21-22]。本文结果也显示，CSR造模成功后，大鼠出现颈椎关节组织炎性反应，PI3K/AKT信号通路蛋白表达减少，这说明PI3K、AKT蛋白参与CSR的免疫反应，也进一步说明PI3K受体调控的免疫反应机制与CSR发病的相关性。本研究还发现，给药组CSR大鼠在芍药甘草汤治疗后PI3K、AKT、Bax表达出现降低，Bcl-2含量增高，这说明芍药甘草汤可有效降低CSR模型大鼠脊髓组织中PI3K、AKT蛋白的表达，从而调控了Bax和Bcl-2等细胞因子，影响细胞凋亡，进而控制CSR的疾病进展。

综上所述，PI3K/AKT信号通路可能通过靶向调控Bax和Bcl-2等细胞因子影响CSR发病过程，这也为我们以后治疗CSR提供了一个新方向。