参芪扶正注射液抑制ERK1/2、GATA4信号通路改善小鼠心力衰竭实验研究

陈仁山，肖惠珍，刘 宁，王 帅，丘文军，杨天化，高忠良，陈清辉

(广州市中西医结合医院，广东 广州 510800)

心力衰竭是各种心脏疾病进展的终末阶段，病情重，预后差[1]。信号通路在心肌肥厚、心力衰竭的发生和进展中起重要作用，有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路是其中重要的一条[2]。研究显示，手术诱导心脏后负荷增加，可以激活MAPK/ERK1/2/GATA4信号通路，诱发心肌肥厚和心力衰竭发生。中医认为心衰的基本病机是本虚标实，虚实夹杂，本虚以气虚为主[3]，益气扶正是心衰的重要治法。参芪扶正注射液具有益气扶正作用，对心力衰竭有良好的治疗效果[4-5]，但其作用机制尚未明确。本文采用参芪扶正注射液治疗心力衰竭小鼠，观察其作用并探讨其具体信号转导机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 从广东省医学实验动物中心购买8～10周龄SPF级C57BL/6J小鼠50只，体重18～22 g，合格证号：SYXK(粤)2018-0085。适应性饲养7 d，随机分为正常组、模型组、阳性组、SQ低剂量组、SQ高剂量组，每组各10只。

1.2 实验设备与试剂 LED数显圆周摇床、混悬仪(购自赛洛捷克公司，型号分别为：SLK-O3000-S、SCI-VS)，迷你垂直电泳槽、迷你转印槽、基础电泳仪电源(购自韦克斯WIX公司，型号分别为：miniPRO4、miniBLOT、EP300)，凝胶成像仪(购自BIO-RAD公司)，VEVO 2100超声心动仪(购自加拿大Visual Sonics公司)。ERK1/2抗体、GATA4抗体、Phospho-ERK1/2抗体、HPR二抗(购自Affinity公司，批号分别为：AF0115、AF5245、AF1015、AF7011)，BCA蛋白浓度测试盒(购自贝博公司，批号：BB20101)，血清BNP-Elisa试剂盒(购自北京普天同创生物科技有限公司，批号：MM-0060M1)。

1.3 实验药物 99.0%盐酸异丙肾上腺素(Isoprenaline hydrochloride,ISO)(批号：C10935510)，琥珀酸美托洛尔缓释片(批号：2005117)，参芪扶正注射液(批号：190907)。

1.4 动物造模和给药方法 通过皮下植入渗透压泵的方式建立小鼠心衰模型。小鼠吸入4.5%异氟烷气体进行麻醉，后颈部剃毛消毒，剪开约1 cm切口，植入灌注ISO溶液或蒸馏水的渗透压泵，缝合切口，碘伏消毒。除空白对照组，其余四组通过渗透压泵连续14 d皮下给予30 mg/(kg·d)的ISO进行心力衰竭模型的建立。正常组通过渗透压泵皮下给予相同给药时间、相同流速的蒸馏水。心力衰竭模型建立成功后，SQ低剂量组腹腔注射20 ml/kg参芪扶正注射液，SQ高剂量组腹腔注射40 ml/kg参芪扶正注射液，阳性组给80 mg/kg琥珀酸美托洛尔缓释片灌胃，疗程14 d。正常组和模型组腹腔注射相应的0.9%氯化钠溶液。

1.5 实验室观察及检测方法

1.5.1 小鼠超声心动图检测：小鼠吸入4.5%异氟烷气体进行麻醉，前胸部剃毛消毒。使用VEVO 2100超声心动仪检测小鼠左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短轴缩短率(Left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5.2 ELISA检测血清中BNP浓度：小鼠摘取眼球采血1 ml离心后取上清液，按照ELISA试剂盒方法检测血清中BNP浓度。

1.5.3 脏器系数及病理切片检测：采血结束后，迅速处死小鼠，取出心脏及肺组织，利用预冷的PBS洗净，吸水纸吸干后，立即称重并记录，计算脏器系数(脏器重量/体重×100%)。放入4%多聚甲醛中固定制作病理切片，显微镜下观察各脏器病理变化。

1.5.4 Western blot检测小鼠心肌细胞中磷酸化ERK1/2、总ERK1/2、GATA4蛋白的表达：取小鼠心肌组织，加入含PMSF的裂解液，低温离心取上清液。BCA法行蛋白定量，计算出蛋白浓度和上样量。按照标准Western blot检测方法，检测小鼠心肌细胞中磷酸化ERK1/2、总ERK1/2、GATA4蛋白的表达。

2 结 果

2.1 各组小鼠心脏彩超显像比较 见表1(图1)。与正常组相比，模型组LVEF和LVFS水平均明显降低(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、SQ低剂量组、SQ高剂量组LVEF和LVFS水平均明显升高(P<0.05)，且SQ高剂量组优于SQ低剂量组(P<0.05)。

图1 各组小鼠心脏超声显像比较

表1 各组小鼠心脏彩超显像比较(%)

2.2 各组小鼠血清BNP浓度比较 见表2。与正常组相比，模型组血清BNP浓度明显升高(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、SQ低剂量组、SQ高剂量组血清BNP浓度均降低，均有统计学差异(P<0.05)，且SQ高剂量组低于SQ低剂量组(P<0.05)。

表2 各组小鼠血清BNP浓度比较(pg/ml)

2.3 各组小鼠脏器系数比较 见表3。与正常组相比，模型组心脏系数和肺脏系数均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、SQ低剂量组、SQ高剂量组心脏系数和肺脏系数均明显降低(P<0.05)。

表3 各组小鼠脏器系数比较(g/kg)

2.4 各组小鼠心脏病理切片 见图2。正常组心脏组织内心肌细胞横纹清晰，细胞核位于中间，核周围可见点状放射状排列的肌原纤维或排列整齐的心肌纤维，亦无心肌水肿、瘀血、变性及炎细胞、中性粒细胞等浸润。模型组心肌细胞界限不清晰，体积增大，心肌纤维化，部分发生钙化，亦有炎症、中心粒细胞浸润。阳性组、SQ低剂量组、SQ高剂量组心肌纤维大部分完整，心肌细胞界限大部分清晰无炎症浸润，但SQ低剂量组仍有部分心肌细胞钙化。

图2 各组心力衰竭小鼠心脏病理切片(HE染色，×200)

2.5 各组小鼠心肌组织中ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表达比较 见图3、4。将GAPDH设为内参，与正常组比较，模型组ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表达均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，阳性组、SQ低剂量组及SQ高剂量组ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表达均明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 各组小鼠心肌组织中ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表达

与模型组比较，*P<0.05；与正常组比较，#P<0.05

3 讨 论

心力衰竭是心脏疾病的终末阶段。据估计，我国心力衰竭患者约890万[6]。以肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统为代表的神经内分泌系统过度激活是引起心室重构进而导致心衰发作的重要病理机制[1]。信号通路转导在心衰的发生和进展中起重要作用。机体产生的刺激或细胞因子，最后都需要通过各种信号通路，进行心肌细胞膜内外信号转导，最终影响蛋白表达而起作用。研究表明，MAPK信号通路参与心肌肥厚、心力衰竭的进程[7-8]。

MAPK信号通路是真核细胞的一个重要信号系统，能将多种细胞外刺激信号从细胞膜传递至细胞核内，从而调节细胞分化、增殖和肥大[9]。胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族中的一员，分布于胞质中，具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化的能力，可以被各种刺激活化，被激活的磷酸化ERK1/2由胞质转入胞核，在细胞核内介导核因子κB(NF-κB)、GATA结合蛋白4(GATA4)、即刻早期基因(c-fos)等转录因子活化，进而调节靶基因转录和蛋白表达，产生生物学效应。研究显示ISO可以激活ERK1/2/GATA4信号通路，诱发小鼠心肌肥厚和心肌细胞肥大[10]，使用专门的靶向抑制剂抑制肌小节的ERK-GATA4信号通路，可抑制心肌细胞肥大[11]。

GATA4是调控心肌基因表达的重要转录因子，是多种刺激和信号通路的下游效应因子，在心肌肥厚的发生发展过程中发挥重要作用[11]。ERK1/2可直接磷酸化GATA4分子结构上的Ser105位点，增强其转录活性[12]。GATA4在胞核内既可以直接调控，也可以利用自身结构和其他转录因子相互协同，调控心肌特异性基因的表达，例如：肌钙蛋白Ⅰ、脑钠尿肽、肌球蛋白重链等基因，增加蛋白合成，增大心肌细胞体积[13-14]。研究证实，在小鼠心脏和心肌细胞，GATA4的过度表达可引起心肌肥厚产生。用带有GATA4的腺病毒感染心肌细胞，24 h或48 h后可见显著的肥大反应，细胞体积明显增大，肌小节组织显著增生[15]。

本实验显示，采用ISO刺激小鼠，与对照组相比较，模型组小鼠心脏、肺脏系数增大，反映心脏、肺脏重量增加，心脏彩超检查提示LVEF、LVFS降低，BNP升高，反映小鼠心脏收缩功能下降，病理检查提示心肌细胞体积增大，心肌纤维化，ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表达明显升高。以上结果均提示，经ISO处理可以使小鼠心脏增大，心肌细胞肥大，心肌纤维化，心脏收缩功能下降，甚至肺水肿产生，这些可能与激活心脏MAPK/ERK1/2/GATA4信号通路相关。

中医认为心气充沛、血液充盈、脉管通利是血液在全身正常运行的基础，其中充沛的心气是重要的推动力，心气推动气血津液经过脉管运行全身，以维持机体基本生理功能。心气具有推动和温煦作用，若心气不足或亏虚，则推动和温煦作用减弱，不能有效推动气血津液流动，会产生瘀血、痰浊、水饮等实邪，阻滞气机，影响气血运行，使心失濡养，产生胸闷、气短乏力、动则加重等心衰症状。《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》认为心衰属本虚标实之证，心气亏虚为发病之本，因此，益气扶正是辨治心衰的重要治法。参芪扶正注射液由党参、黄芪提取而成，具有益气扶正功效。其中，黄芪具有提高心室收缩功能，减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤[16]，抑制心肌肥厚[17]，激活自噬、抑制心肌细胞凋亡[18]等作用。党参具有增强心肌收缩力、增加心输出量，改善机体血液流变学和微循环等作用[19]。参芪扶正注射液治疗心衰患者，可以增强心肌收缩力，减轻心肌细胞内钙超载、抑制细胞凋亡，降低血浆中血管紧张素Ⅱ和内皮素-1浓度，抑制心室重构[20]。

在慢性心衰的治疗中，β受体阻滞剂是一类重要的治疗药物，本实验选取琥珀酸美托洛尔缓释片作为阳性对照，一是考虑心衰的治疗，二是作为ISO的拮抗剂。实验显示，与模型组比较，阳性组、SQ低剂量组和SQ高剂量组小鼠心脏、肺脏系数减小，LVEF、LVFS升高，BNP下降，心肌纤维化减轻，ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表达下降，提示琥珀酸美托洛尔缓释片和参芪扶正注射液可改善心衰小鼠的心脏收缩功能，减轻心肌纤维化，抑制MAPK/ERK1/2/GATA4信号通路。其中，SQ高剂量组效果优于SQ低剂量组，在某些方面，高剂量的参芪扶正注射液甚至与美托洛尔缓释片具有同等效果。

综上所述，本研究从心脏彩超、病理、血清、免疫印迹蛋白等方面证实参芪扶正注射液可以改善心力衰竭小鼠的心脏收缩功能、减轻心肌纤维化，这种作用可能与抑制MAPK/ERK1/2/GATA4信号通路有关。