根表铁膜对凤眼莲吸收环丙沙星的影响

冯岚，严岩，韩建刚

1. 南京林业大学土木工程学院，南京 210037 2. Ecological Complexity and Modeling Laboratory, Department of Botany and Plant Sciences, University of California, Riverside, CA, 92521, USA 3. 江苏省环境科学研究院太湖水污染防治研究中心，南京 210042 4. 南京林业大学环境与生物学院，南京 210037 5. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京 210037 6. 江苏洪泽湖湿地生态系统国家定位观测研究站，洪泽 223100

抗生素被广泛地应用在畜牧业和水产养殖业。近年来，抗生素药物在生态环境中造成的影响引起了国内外学者乃至公众的广泛关注[1]，其中水生生态环境海洋、湖泊、湿地甚至是饮用水中经常检测到抗生素的存在[2-5]。抗生素在水生态系统的水体中检测水平可从μg·L-1达到mg·L-1[6-7]，而在沉积物中的水平可从μg·kg-1达到mg·kg-1[7-8]。环境中残留的抗生素通过食物链扩散和生物扩大效应威胁到人类的健康安全[9]。其中，氟喹诺酮类抗生素环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)由于具有广谱性抗菌活性而被广泛应用，经常在环境中被检出[10-11]。因此，生态环境中抗生素去除问题备受人们关注。

近年来，高级氧化法、生物炭吸附法和膜过滤技术等方法能够高效地去除环境中抗生素[12-14]。但这些方法成本较高，且易造成二次污染，不能广泛地被推广应用。植物修复是一种高效、低成本和生态安全技术，植物通过吸收、转化和降解等方式去除水体中抗生素[15-16]。水生植物为了适应淹水和其他环境胁迫会在根际表面形成铁氧化物胶膜(简称铁膜)，其中，水环境中铁离子浓度是根表铁膜形成的主要影响因素[17]。植物根表铁膜通过吸附和共沉淀等作用对磷、砷等具有较强的吸附和降解能力[18-19]，然而，也有研究表明植物根表铁膜阻碍营养元素或金属离子的吸收[18]。目前，水生植物根表铁膜对抗生素吸收的影响还鲜有报道。

本试验中通过探究根表铁膜对漂浮植物凤眼莲吸收抗生素CIP的影响，分析不同浓度铁离子处理下凤眼莲根表铁膜形成量和根系生理生化变化及对水质的影响，揭示根表铁膜对CIP的吸附特征及根系对CIP的吸收特征，为植物修复抗生素污染的水体提供理论支撑。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

漂浮植物凤眼莲(Eichhorniacrassipe)采集于南京师范大学植物园的池塘中。抗生素CIP纯度>98%，化学试剂甲醇和乙腈(色谱纯)、磷酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、连二亚硫酸钠、石蜡和柠檬酸钛等均为分析纯，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 试验方法

在南京师范大学植物园温室中开展试验。选用的凤眼莲体内未检测到CIP残留，自来水冲洗植株，在实验桶中用1/2 Hoagland溶液培养7 d。完全随机区组实验设计，CIP浓度设置为0.1 mg·L-1，Fe2+(FeSO4·7H2O)浓度设为0、10、20、50、100和150 mg·L-16个水平，共6个处理。用1/2 Hoagland营养液配制处理液，从培养的植株中选取质量和大小相似的3株放入装有100 L处理液的实验桶中，每桶视为1个处理，3次重复，共计18个桶。试验桶的表面和四周用锡纸包裹，避免抗生素光降解。期间定期地添加去离子水补充桶中蒸发的水分。处理第7天分别测定植物根表铁膜量、根表CIP含量、根系泌氧量、根系孔隙度、根系活力和植物根系中CIP的含量以及水质指标。

1.3 测定项目与方法

植物根系内抗生素测定[20]：取1.0 g在冷冻干燥机(Biosafer-10A，赛飞，中国)中冷冻干燥后的植物，于研钵中研磨均匀后置于50 mL离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaine提取液。Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液配制：称取柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠27.5 g、乙二胺四乙酸二钠37.2 g,溶于水中并定容1 L(pH 4)。先用涡旋振荡器震荡30 s，再用超声震荡器震荡15 min，最后将离心管置于8 000 r·min-1的条件下离心10 min，倾出上清液于另一个清洁的50 mL离心管中，剩余的残渣按以上步骤重复提取2次，合并上清液于50 mL离心管中后9 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液用微孔滤膜进行过滤，最后将滤液用超纯水稀释至200 mL，加入约40 μL盐酸调节水样pH为3.0左右，加入0.2 g Na2EDTA。将Oasis HLBSPE小柱(6 mL，500 mg)进行富集净化。上样前，HLB小柱依次用6 mL甲醇和6 mL超纯水以及6 mL 10 mmol·L-1Na2EDTA缓冲溶液(pH 3)进行活化；上样时，流速控制在10 mL·min-1左右；上样后，先用10 mL水清洗HLB小柱，然后在负压下抽干1 h；最后用6 mL甲醇洗脱。洗脱液在35 ℃下用氮气吹干浓缩至1 mL以下，最后用40%甲醇水溶液定容至1 mL，待测。CIP的提取液使用高效液相色谱仪(Agilent 1290，安捷伦，美国)进行定量分析，色谱柱为Zorbax 300SB-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈和0.025 mol·L-1磷酸水溶液(体积比为15∶85)，流速1 mL·min-1，进样量10 μL，DAD检测波长为278 nm。

根表铁膜的测定：采用连二亚硫酸钠-柠檬酸钠-重碳酸钠法(DCB法)进行测定，将根系用去离子水清洗干净并剪成约1 cm长，将根装入250 mL的三角瓶中，然后依次加入0.3 mol·L-1柠檬酸钠40 mL、1 moL·L-1碳酸氢钠5 mL，最后加入3 g连二亚硫酸钠，摇匀后在室温条件下震荡3 h，然后将根系取出并用去离子水重复清洗3次，将清洗液和提取液倒入100 mL容量瓶中，最后定容至刻度。采用原子吸收分光光度法测定提取液中的铁。采用DCB提取液中铁含量与DCB提取后根系干质量之比计算根表铁膜量。

植物根表抗生素的测定：样品提取方法同根表铁膜的提取方法，抗生素测定采用高效液相色谱法，方法同上。根表吸附的抗生素含量是用DCB提取液中抗生素量与DCB法提取后根系干质量之比表示[21]。

根系泌氧量的测定：采用柠檬酸钛比色法对植物根系泌氧量进行测定。在500 mL烧瓶中加入195 mL 0.1倍Hoagland营养液，然后再通入高纯氮15 min去除营养液中的氧气。选取生长情况相近3株植物，将其所有根系浸没于培养液中进行光照培养，同时设一组无植物的空白对照处理组。在营养液表面缓慢地倒入约2 cm厚的液体石蜡，在石蜡层下加入5 mL柠檬酸钛溶液并轻轻地摇匀，上述所有操作均在氮气吹扫的条件下进行。植物组与对照组都在恒温培养箱中按设定温度培养3 h后，取营养液样品3 mL在527 nm处进行比色分析，然后计算根系泌氧量[22]。

植物根系孔隙度的测定：采用Kludge的方法[23]测定植物根系的孔隙度。将25 mL比重瓶装满水称重，记为P，将植物根系清洗干净后去除表面的水体，称取0.3 g的植物根系装入比重瓶中，称重记为Pr。然后将装有植物根系的比重瓶抽真空2 h，取出的根系用研钵磨碎后放入比重瓶，装满水后称重记为Pgr。则根系孔隙度可以表示为：

(1)

式中：Por为根孔隙度(%)；r为根质量(g)。

1.4 数据处理

试验结果的显著性分析采用那肯氏新复极差多重比较法(DMRT)，以0.05作为显著性水平。数据分析、作图采用SPSS 19.0(IBM，美国)和Origin 8.0(Originlab，美国)。

2 结果(Results)

2.1 环境因子的变化特征

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，水溶液中溶解氧含量随着Fe2+离子处理浓度的增加而显著降低(图1(a))，Fe2+离子浓度为0 mg·L-1处理组，水体中溶解氧含量是10 mg·L-1处理组1.0倍，是20 mg·L-1处理组1.2倍，是50 mg·L-1处理组1.2倍，是100 mg·L-1处理组1.4倍，是150 mg·L-1处理组1.5倍。水溶液中pH值随着Fe2+离子浓度的增加而显著降低(图1(b))，Fe2+离子浓度为10 mg·L-1的处理组，水体中pH值是20 mg·L-1处理组1.0倍，是50 mg·L-1处理组1.6倍，是100 mg·L-1处理组1.6倍，是150 mg·L-1处理组1.7倍。水溶液中氧化还原电位(OPR)值随着Fe2+离子处理浓度的增加而增加(图1(c))，在处理浓度为100 mg·L-1和150 mg·L-1时，OPR值显著高于其他处理浓度组，分别比对照组高213 mV和346 mV。

图1 Fe2+不同浓度条件下水环境因子变化特征注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，溶解氧、pH和 氧化还原电位差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig. 1 Characteristics of water environmental factors under different Fe2+ concentrationNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference in dissolved oxygen, pH and redox potential under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2 凤眼莲根系生理生化变化特征

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，0 mg·L-1Fe2+处理组，凤眼莲根系孔隙度比10 mg·L-1处理组增加7.19%，比20 mg·L-1处理组增加3.84%，比50 mg·L-1处理组降低4.74%，比100 mg·L-1处理组降低2.30%，比150 mg·L-1处理组增加0.71%(图2)，随着铁浓度的增加，凤眼莲根系孔隙度呈现出先增加后降低的趋势。

图2 Fe2+不同浓度对根系孔隙度的影响注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，根孔隙度差异不显著。Fig. 2 Effects of different Fe2+ concentrations on root porosityNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between root porosity under different Fe2+ concentration conditions.

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，随着水溶液中Fe2+浓度逐渐增加，凤眼莲根系泌氧量的变化情况如图3所示。Fe2+浓度为0 mg·L-1处理组，凤眼莲根系泌氧量比10 mg·L-1处理组增加27.27%，比20 mg·L-1处理组降低22.72%，比50 mg·L-1处理组增加4.45%，比100 mg·L-1处理组降低4.45%，比150 mg·L-1处理组降低18.18%。随着Fe2+浓度的增加，凤眼莲根系泌氧量呈现出先增后降趋势，在20 mg·L-1时最高。

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，水溶液中Fe2+浓度逐渐增加，凤眼莲根系活力的变化如图4所示。Fe2+浓度为150 mg·L-1处理组，凤眼莲根系活力是0 mg·L-1处理组1.9倍，是10 mg·L-1处理组1.7倍，是20 mg·L-1处理组1.6倍，是50 mg·L-1处理组1.4倍，是100 mg·L-1处理组1.2倍，但不同浓度处理间无显著差异(P>0.05)。

2.3 凤眼莲根表铁膜量的变化特征

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，随着水溶液中添加Fe2+浓度增加，凤眼莲根表铁膜量逐渐增加。Fe2+浓度为150 mg·L-1处理水平下凤眼莲根表铁膜量是0 mg·L-1处理组1.9倍，是10 mg·L-1处理组1.5倍，是20 mg·L-1处理组1.5倍，是50 mg·L-1处理组1.2倍，是100 mg·L-1处理组1.1倍(图5)。Fe2+浓度>50 mg·L-1时，各浓度处理下的凤眼莲根表铁膜量显著高于对照处理(P<0.05)。

图3 Fe2+不同浓度对根系泌氧量的影响注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，根系泌氧量 差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig. 3 Effects of different Fe2+ concentrations on radial oxygen lossNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between radial oxygen loss under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

图4 Fe2+不同浓度对根系活力的影响注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，根系活力差异不显著。Fig. 4 Effects of different iron concentrations on root activityNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between root activity under different Fe2+ concentration conditions.

图5 Fe2+不同浓度对根表铁膜量的影响注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，铁膜量 差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig. 5 Effects of different Fe2+ concentrations on root iron plaqueNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between amount of iron film under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4 凤眼莲根系表面和根系中CIP浓度变化

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，随着水溶液中Fe2+浓度的增加，凤眼莲根系表面吸附的CIP浓度逐渐增加(图6)，Fe2+浓度为150 mg·L-1处理组，凤眼莲根表吸附CIP浓度是0 mg·L-1处理组2.1倍，是10 mg·L-1处理组1.6倍，是20 mg·L-1处理组1.3倍，是50 mg·L-1处理组1.2倍，是100 mg·L-1处理组1.1倍。

在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，水溶液中添加Fe2+浓度逐渐增加，凤眼莲根系中CIP浓度显著降低(图7)。随着水体中Fe2+浓度的增加，凤眼莲根系中CIP浓度逐渐降低，浓度为0 mg·L-1处理组，凤眼莲根系中CIP浓度是10 mg·L-1处理组3.5倍，是20 mg·L-1处理组11.5倍，是50 mg·L-1处理组12.9倍，是100 mg·L-1处理组22.9倍，是150 mg·L-1处理组36.2倍。

3 讨论(Discussion)

环境介质中铁离子的有效性和溶解性影响植物根表铁膜的形成，其中Fe2+含量是直接影响根表铁膜数量的重要因素[24]。水体中添加Fe2+后，水环境中的溶解氧含量和pH值降低，主要由于水体中Fe2+氧化为Fe3+，且添加的Fe2+(FeSO4·7H2O)是酸性[25-26]。然而，凤眼莲根表铁膜量逐渐增加，与已有的研究结果相似[27-28]。

图6 Fe2+不同浓度对根表抗生素环丙沙星(CIP)浓度的影响注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，根表抗生素CIP差 异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig. 6 Effects of different Fe2+ concentrations on ciprofloxacin (CIP) contents of rootNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between root surface antibiotics CIP under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

图7 不同浓度Fe2+对根系中CIP浓度的影响注：具有相同小写字母表示Fe2+不同浓度条件，根系中CIP差异 不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig. 7 Effects of different Fe2+ concentrations on the CIP concentrations in rootNote: The same lowercase letters indicate that there is no significant difference between CIP in roots under different Fe2+ concentration conditions, but different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

在抗生素CIP胁迫下，Fe2+不同浓度对凤眼莲根系生理生化影响各异。植物根系孔隙度能够较好地表示植物根部通气组织的发达程度[29]，Fe2+不同浓度对凤眼莲根系孔隙度无显著影响。水生植物根部生长在水中或底泥内，长期处于缺氧或者无氧条件，其根部的各项生理生化活动都需要植株向下输氧，植物根系越发达所需的氧气含量就越大，所需释放氧气的速率也较大[30]。已有研究显示，植物根系孔隙度与根系泌氧量有正相关性[31]，而本研究中凤眼莲根系孔隙度与根系泌氧量无显著相关性，且不同浓度Fe2+处理下凤眼莲根系泌氧量未达到显著差异(P>0.05)。植物根系活力直接反映根的生长情况和活力水平，直接影响着茎叶部分的生长与营养状态[32-33]。可能与凤眼莲的根系结构有关。凤眼莲根系被诱导形成根表铁膜后，促进了根系不定根活力的增加，添加Fe2+浓度最大时，凤眼莲根系活力越强，在一定程度上影响着其对物质的吸收作用。

植物根系表面对有机污染物具有吸附作用[34]，Fe2+浓度越高，凤眼莲根表吸附CIP浓度就越高，可能是由于植物根表铁膜上具有较多的负电荷基团，能够增加CIP吸附点位[35]，且Fe2+不同浓度处理下凤眼莲根表铁膜量与根表抗生素浓度呈正相关(r=0.954)，说明凤眼莲根表铁膜对CIP具有吸附作用。在CIP浓度为0.1 mg·L-1条件下，水溶液中添加Fe2+(FeSO4·7H2O)浓度逐渐增加，凤眼莲根系中CIP的浓度显著降低。凤眼莲根系中CIP浓度与根表铁膜量和根表CIP浓度变化规律相反。凤眼莲根表吸附的CIP含量越多，进入根系中的含量就越低，凤眼莲根表铁膜量的增加阻碍了根系对抗生素的吸收，可能由于凤眼莲根表上铁离子浓度增加，与抗生素发生络合反应而阻碍了根系对抗生素的吸收[36-38]。

根表铁膜作为营养物质和污染物进入植物体内的第一道防线，已经成为环境科学研究中的热点问题，研究其作用机理和调控机制具有重要的生态环境意义。目前主要研究集中在对污染物胁迫下，植物根表铁膜对污染物的吸收影响及植物根系生理生化变化，对植物根系分泌物、根际微生物等影响铁膜的形成及发挥效应还有待进一步探究。