复方丹参滴丸通过调控凋亡相关蛋白的表达抑制TNF-α诱导的人牙周膜成纤维细胞凋亡

江 瑾 于春华 仇 妮 王 芳 张 明

人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament cells，hPLFCs）是一种具有多向分化功能的群体细胞，是牙周组织增殖过程中起主导作用的细胞[1]。hPLFCs的凋亡是牙周组织破坏的重要病理生理过程，hPLFCs的凋亡已被认为是牙周炎、根尖周炎的病理生理因素之一[2]。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一种重要的影响hPLFCs细胞功能的外界刺激因子。TNF-α对于hPLFCs生物学特性的影响受到越来越多学者广泛关注[3，4]。研究表明，TNF-α可以诱导hPLFCs发生细胞凋亡[5]。寻找具有抑制hPLFCs细胞凋亡作用的药物，是近年来药物研究的热点之一。

复方丹参滴丸（compound danshen dripping pills，CDDP）是利用现代制药技术研制而成的一种纯中药滴丸剂，主要成分为丹参、三七和冰片，其主要成分是丹参水溶性成分和三七的水溶性成分。该药起效快，副作用小，生物利用度高，具有活血化瘀、理气止痛之功能，在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的预防、治疗、急救，在扩张血管、清除自由基、改善微循环等方面具有一定的临床价值[6～9]。目前，有关CDDP在牙周疾病中对于TNF-α诱导牙周组织凋亡作用的研究尚不多见。因此，本研究拟通过TNFα诱导hPLFCs细胞凋亡，探讨CDDP对于hPLFCs细胞凋亡的影响及机制，为进一步的深入研究与临床应用奠定基础。

资料和方法

1.实验试剂和仪器：复方丹参滴丸（天士力医药集团股份有限公司）；TNF-α、MTT（Sigma公司）；胎牛血清FBS（Gibco公司）；α-MEM培养基（Hyclone公司）；Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒（上海博谷生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒、PVDF蛋白转印膜（碧云天生物技术研究所公司）；anti-p53抗体、anti-Bax抗体、anti-Bcl-2抗体和anti-β-actin抗体（Santa Cruz公司）；超净工作台（苏州净化有限公司）；酶标仪与电泳装置（美国Bio-Rad公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）。

2.hPLFCs的体外培养：hPLFCs（武汉普诺赛生命科技有限公司），于5% CO2、37℃下培养于α-MEM培养基中，常规换液，待细胞长至80%后，0.25%胰蛋白酶消化传代培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

3.MTT法检测TNF-α对hPLFCs增殖的影响胰酶消化细胞，制备单细胞悬液，细胞以5×104个/孔接种于96孔培养板中。培养24h后，加入不同浓度TNF-α（25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL），继续培养24h。吸弃培养基，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL溶于PBS），置于37℃恒温箱中孵育4h。吸去上清后，每孔加入150μL二甲基亚砜随后震荡10min溶解蓝色结晶。用酶标仪在490nm波长下测量其吸光度值。

4.CDDP溶液的制备：将CDDP置于研钵内研碎，培养基溶解，超声30min使药完全溶解，现配现用。

5.实验分组处理：实验分为3组：正常对照组：含5% FBS的DMEM培养基培养；TNF-α组：对照培养基加入200ng/mL TNF-α；TNF-α+CDDP组：对照培养基中加入200ng/mL TNF-α与270mg/mL、540mg/mL、1080mg/mL CDDP。

6.流式细胞仪检测hPLFCs细胞凋亡：细胞接种于24孔板中，细胞经不同实验组预处理48h后，4℃预冷的PBS将各组细胞洗涤2次，加入含0.25%胰酶消化并收集细胞。随后加入1mL的1倍Annexin V结合缓冲液，800r/min离心5min弃上清。加入结合缓冲液200μL重悬细胞。在细胞悬液中加入5mg/L的Annexin V-FITC 10μL及PI 5μL，混匀后37℃避光孵育30min。流式细胞仪以488nm为激发波长，530nm为发射波长检测细胞凋亡率。

7.Western blot检测hPLFCs凋亡相关蛋白的表达：细胞接种于6孔板中，细胞经不同实验组预处理24h后，PBS洗涤细胞，胰酶消化并收集细胞。加入细胞蛋白裂解液RIPA，提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。取30μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳分离总蛋白后，湿转法进行PVDF电转膜。用5%脱脂奶粉在室温下封闭1h，分别加入1:2000稀释的鼠抗人p53、Bax、Bcl-2和β-actin一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入1:1000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1h，TBST洗膜。曝光分析结果，蛋白相对表达量以待测蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示。

8.统计学分析：采用SPSS 21.0分析，统计学分析采用单因素方差分析进行，所有数据以均数±标准方差表示，P＜0.05表示有统计学意义。

结 果

1.不同浓度TNF-α对hPLFCs增殖的影响：结果表明，hPLFCs细胞增殖与TNF-α浓度相关。与对照组相比，25ng/mL TNF-α作用的hPLFCs增殖变化不明显；50ng/mL TNF-α细胞增殖略微下降；100ng/mL TNF-α细胞增殖显著下降；200 ng/mL TNF-α细胞增殖下降程度更大（图1）。因此，采用200ng/mL TNF-α进行后续实验。

图1 不同浓度TNF-α对hPLFCs增殖的影响

2.CDDP对TNF-α诱导的hPLFCs增殖的影响结果表明，与对照组相比，TNF-α处理组的hPLFCs细胞增殖明显降低。与TNF-α组相比，CDDP组细胞增殖显著升高，且1080mg/mL CDDP组显著高于540mg/mL CDDP组，1080mg/mL与540mg/mL CDDP组均显著高于270mg/mL CDDP组（图2）。

图2 不同浓度CDDP对TNF-α诱导hPLFCs增殖的影响

3.流式细胞仪检测CDDP对于TNF-α诱导的hPLFCs细胞凋亡的影响：结果显示，对照组、TNF-α组、TNF-α+CDDP 270mg/mL组、TNF-α+CDDP 540mg/mL组、TNF-α+CDDP 1080mg/mL组的细胞凋亡率（Q2+Q4）分别是6.8%、35.9%、23.6%、16.6%、10.6%。与对照组比较，hPLFCs细胞经TNF-α作用后，细胞凋亡率显著增加。但是，CDDP组与TNF-α组相比细胞凋亡率显著降低，且1080mg/mL CDDP组分别显著低于540mg/mL CDDP组与270mg/mL CDDP组，540mg/mL CDDP组显著低于270mg/mL CDDP组（图3）。

图3 不同浓度CDDP对TNF-α诱导人hPLFCs细胞凋亡的影响

4.蛋白免疫印迹法检测CDDP对于TNF-α诱导的hPLFCs凋亡相关蛋白的影响：结果显示，与对照组相比，p53、Bax在TNF-α组表达明显升高，Bcl-2蛋白表达显著降低。与TNF-α组比较，CDDP组p53、Bax蛋白表达逐渐下降。并且，1080mg/mL CDDP组分别显著低于540mg/mL CDDP组与270mg/mL CDDP组，540mg/mL CDDP组 低 于270mg/mL CDDP组。除此之外，与TNF-α组比较，CDDP组Bcl-2蛋白表达逐渐升高，1080mg/mL CDDP组分别显著高于540mg/mL CDDP组与270mg/mL CDDP组（图4）。

图4 不同浓度CDDP对TNF-α诱导hPLFCs凋亡相关蛋白表达的影响

讨 论

hPLFCs细胞凋亡是一个由多种细胞因子、多种细胞信号转导通路参与的复杂的病理生理过程。针对hPLFCs细胞凋亡信号转导通路的研究不仅有助于更深入地探讨牙周病、根尖周病发病的分子机制，也为其防治研究提供了更多可能有效的干预环节。因此，本研究使用TNF-α诱导hPLFCs细胞凋亡，检测CDDP对细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的影响，探索CDDP对hPLFCs细胞凋亡的抑制作用。

本实验用流式细胞仪检测hPLFCs的凋亡率，观察到培养液中加入200ng/mL TNF-α作用正常细胞48h后，与对照组比较，hPLFCs的凋亡率明显增高，这与文献报道[10，11]是一致的。紧接着，采用流式细胞仪检测CDDP对TNF-α诱导的hPLFCs细胞凋亡的影响。CDDP是第一个被美国FDA批准进入治疗心血管疾病II期临床试验的中药[12]。研究表明CDDP可以通过抑制糖尿病大鼠细胞凋亡发挥神经保护作用[13]。本研究的结果显示，与TNF-α组比较，给予不同浓度的CDDP作用48h后，细胞凋亡率有所下降，且随CDDP浓度的增大，hPLFCs的凋亡率下降的越明显，说明CDDP可以有效抑制TNF-α诱导的hPLFCs细胞的凋亡。

Bcl-2/Bax比值在介导细胞凋亡过程中发挥着重要作用。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，而Bax具有直接促进细胞凋亡的作用，Bcl-2和Bax是正负调控的凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值决定着细胞区域凋亡还是存活[14]。p53是另一个介导细胞凋亡的调节蛋白，当细胞受到损伤、辐射等影响时，p53表达上调并介导细胞凋亡[15，16]。本实验中采用Western blot检测TNF-α对于hPLFCs细胞凋亡的影响。结果显示，TNF-α作用于hPLFCs后，hPLFCs出现大量凋亡，细胞内Bcl-2蛋白表达明显下降，Bax、p53蛋白表达水平明显上调。但是，加入不同浓度CDDP作用后，细胞的凋亡率呈现下降趋势，Bcl-2表达呈现剂量依赖性上升，Bax、p53表达水平呈现剂量依赖性下降。由此可见，hPLFCs存在Bcl-2、Bax、p53介导的细胞凋亡途径，这些凋亡蛋白的高表达和失衡导致了细胞的大量凋亡，甚至导致牙周组织受损；而CDDP对TNF-α诱导的hPLFCs凋亡相关蛋白的表达有一定的抑制作用，可以起到保护牙周组织的作用。