小鼠脂肪间质干细胞源胞外囊泡激活蛋白激酶B促进卵巢癌细胞增殖迁移和上皮间质转化

沈娜惠,孙晓春

(1.江苏大学医学院,江苏 镇江 212013；2.常州市第四人民医院检验科,江苏 常州 213000)

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一,在女性致命疾病中排名第四[1-2]。由于卵巢癌早期不易诊断,约61%卵巢癌患者在诊断时已发生远处转移,预后较差[3]。目前,卵巢癌转移的机制复杂且不明确。肿瘤微环境是指肿瘤细胞存在的周围微环境,包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质等[4]。据报道,肿瘤微环境对卵巢癌的转移有显著促进作用[5-6]。MSCs和胞外囊泡作为肿瘤微环境中重要的成员影响着肿瘤的发展方向[7]。MSCs是一种来源于发育早期具有高度分化和自我更新能力的多能干细胞,其中脂肪间质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)可通过皮下抽脂等方式获取,来源非常丰富,且其使用无伦理争议。胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一类可由多种细胞类型释放的纳米级膜性小泡,由于其携带的表面抗原标志和内容物与母细胞相似,被认为是“微缩版的干细胞”,在与肿瘤通讯中具有重要的调控作用[8]。目前,因受制于肿瘤源MSCs标本来源的限制,本研究拟以ADSCs代替肿瘤源MSCs并分离EVs,同时以卵巢癌细胞株ID8为研究对象,探讨脂肪间质干细胞源胞外囊泡(ADSC-EVs)对ID8细胞株生物功能的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂和仪器

5～6周龄C57BL/6J雌性小鼠10只购于江苏大学实验动物中心[许可证号:SYXK(苏)2018-0053]；ID8细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；L-DMEM、H-DMEM、胰酶和胎牛血清(美国Gibco公司)；成骨成脂诱导分化培养基试剂盒(美国Cyagen公司)；细胞培养瓶、培养板和Transwell小室(美国Corning公司)；双抗、BCA蛋白浓度检测试剂盒和SDS-PAGE凝胶试剂盒(上海碧云天公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；兔抗小鼠单克隆抗体E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin),蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、CD9、CD81、GAPDH均购自美国CST公司；HRP标记的羊抗兔二抗(上海爱必信公司)；Nanosight可视型纳米颗粒分析仪(英国Nanosight公司)。

二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；化学发光凝胶成像分析系统(美国GE公司)；酶标仪(美国Biotek公司)。

1.2 ADSCs分离培养

将5～6周龄C57BL/6J雌性小鼠脱颈处死后,用乙醇浸泡消毒；在超净台中分离皮下脂肪,去除脂肪组织中的血管。将分离好的脂肪组织剪碎,转移至预先加入0.25% Ⅰ型胶原酶的EP管中,在37 ℃水浴锅中振荡孵育30 min。用70 μm滤器过滤后,300×g离心5 min,弃上清液,用完全培养基重悬细胞沉淀,接种于培养瓶中,静置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h换液。待细胞融合度达70%～80%时,消化传代。第3代至第5代细胞用于后续实验。

1.3 ADSCs鉴定

1.3.1 流式细胞术分析ADSCs表面标志 用胰酶将P3代ADSCs消化成单细胞悬液,每管分装1×106个细胞,加入不同荧光标记的CD抗体。在冰上避光染色孵育30 min,PBS洗涤3遍后重悬细胞,过滤上机检测分析。

1.3.2 ADSCs成骨分化能力鉴定 将P3代的ADSCs按每孔1×104个细胞接种于6孔板中,次日换成骨诱导液,每3 d换骨诱导液1次,直至14 d后,用茜素红染色。

1.3.3 ADSCs成脂分化能力鉴定 将P3代的ADSCs按每孔2×104个细胞接种于24孔板中,待细胞融合度达到90%时,换成脂诱导液A液培养3 d,再换成脂诱导液B液培养1 d,如此交替换液直至21 d后,用油红O染色观察脂滴形成情况。

1.4 胞外囊泡的提取及鉴定

1.4.1 胞外囊泡提取 待P3代ADSCs生长至融合度为80%时,用PBS清洗3次,加入不含EVs的完全培养基,继续培养2 d；收集上清液,于4 ℃行100 000×g超速离心1 h；取沉淀,用PBS重悬,重复上述离心；弃上清液,用BCA法测定ADSC-EVs蛋白浓度,分装于-80 ℃中保存备用。

1.4.2 透射电子显微镜观察ADSC-EVs形态 将待检ADSC-EVs充分混匀后,取10 μL滴加在透射电镜铜网正面；室温下放置30 min,将铜网放入磷钨酸钠溶液中负染5 min；再将铜网放置在白炽灯下烘干；最后,将制备好的铜网放入透射电子显微镜载样器上,进行形态观察并拍照。

1.4.3 纳米粒径分析ADSC-EVs粒径和浓度 将稀释后的ADSC-EVs缓慢注入Nanosight可视型纳米颗粒分析仪中,操作过程避免产生气泡；然后将样品池放置于分析仪中,对处于布朗运动中的ADSC-EVs进行捕捉和分析。

1.4.4 蛋白质印迹实验检测CD9和CD81蛋白表达 使用RIPA裂解液分别裂解ADSC-EVs和ADSCs,提取总蛋白；采用BCA法测定蛋白浓度；行SDS-PAGE,80 V电泳30 min分离蛋白；再将电泳调至100 V,继续电泳1 h；350 mA恒流湿转90 min至PVDF膜；用5%脱脂牛奶在室温封闭1～2 h；4 ℃孵育CD9和CD81一抗过夜(稀释比均为1∶1 000)；TBST漂洗3遍；常温孵育HRP标记的羊抗兔二抗1 h(稀释比均为1∶2 000)；TBST漂洗3遍；ECL曝光显影,凝胶成像系统进行拍照。

1.5 细胞实验

1.5.1 细胞培养及分组 ID8细胞用含10%胎牛血清的H-DMEM培养,将其分为3组,分别用PBS、20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs预处理24 h；胰酶消化收集ID8细胞。

1.5.2 平板克隆实验检测ID8细胞增殖能力 取“1.5.1”分组细胞,接种于6孔板,调整细胞数量为200个/孔(2 mL),在37 ℃含5% CO2培养箱内培养,每3 d换液1次,连续培养7 d；弃培养液,PBS洗涤3遍；4%多聚甲醛固定ID8细胞30 min；PBS洗涤3遍；结晶紫染色10 min；PBS洗涤3遍,拍照并统计分析。

1.5.3 细胞划痕实验检测ID8细胞迁移能力 取“1.5.1”分组细胞,接种于6孔板,调整细胞数为1×105个/孔(2 mL),在37 ℃含5% CO2培养箱内培养；待细胞融合度达到80%时,弃培养液,用无血清培养液清洗3遍；用200 μL枪头在6孔板中央笔直画一条直线,再用无血清培养液清洗3遍；在显微镜下观察划痕处,拍照并记录0 h和24 h时间点划痕宽度。划痕愈合率(%)=(0 h宽度-24 h宽度)/0 h宽度×100%。

1.5.4 Transwell实验检测ID8细胞迁移能力 取“1.5.1”分组细胞,用无血清培养液调整细胞数为1×105个/孔(200 μL),加入Transwell上室中,下室内加入完全培养基600 μL,在37 ℃含5% CO2培养箱内培养10 h；用棉签小心吸干上室内液体,并擦拭未迁移的细胞；将小室转移到4%多聚甲醛中固定30 min；PBS洗涤3遍；室温下用结晶紫染色15 min；PBS洗涤3遍；在显微镜下观察ID8细胞迁移情况,拍照计数并统计分析。

1.5.5 蛋白质印迹实验检测上皮-间质转化(EMT)和AKT相关蛋白表达 取“1.5.1”分组细胞,弃培养液；PBS清洗3遍,置于冰上,加入RIPA裂解液裂解ID8细胞,提取总蛋白；一抗稀释比为1∶1000,二抗稀释比为1∶2000,其余步骤同“1.4.4”,用Image J软件对蛋白条带进行分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 ADSCs分离与鉴定

小鼠脂肪组织原代培养约24 h后,可见大量的呈现短梭形或成纤维样的贴壁细胞,其中也掺杂着如成熟的脂肪细胞等杂细胞(图1A)；经过约3次培养传代后,ADSCs纯度越来越高,形态也呈现典型的长纤维样,细胞长满时可见漩涡样生长(图1A)。第3代ADSCs通过成骨诱导培养基诱导约14 d后,其形态从长梭形变成多边形,茜素红染色可以将胞质染成橘红色(图1B)。通过成脂诱导培养基诱导约7 d后,可见细胞形态从长梭形变成圆形或椭圆形,且胞质中分布大小不一折光性较强的脂滴,油红O染色可将脂滴染成橘红色(图1B)。通过流式细胞术分析第3代的ADSCs表面标志,该群细胞高表达CD29、CD90和CD105,且阳性率均在95%以上,不表达CD19(图1C)。以上结果表明,该类细胞在第3代时具有典型的干细胞形态,具有成骨和成脂多向分化能力,表面标志符合ADSCs的一般表面标志特点且具有较高的纯度。故选用第3代至第5代细胞用于后续实验。

A:原代和第3代ADSCs形态(原代标尺:100 μm；第3代标尺:200 μm)；B:成骨(标尺:200 μm)和成脂诱导(标尺:50 μm)；C:流式细胞术鉴定ADSCs表面标志图1 ADSCs多向分化能力和表面标志鉴定

2.2 ADSC-EVs分离与鉴定

通过透射电镜观察分离的ADSC-EVs,其形态呈现圆形或者椭圆形(图2A)；纳米微粒分析仪检测ADSC-EVs粒径,结果显示其平均粒径为368.6 nm(图2B)；BCA检测其蛋白浓度为5 mg/mL。蛋白质印迹结果显示,ADSC-EVs表达CD9和CD81蛋白分子(图2C)。由此表明,成功提取出ADSC-EVs。

A:透射电子显微镜观察ADSC-EVs形态；B:纳米微粒分析ADSC-EVs粒径；C:蛋白质印迹实验检测ADSC-EVs表面CD9和CD81表达图2 ADSC-EVs的形态及鉴定

2.3 ADSC-EVs促进ID8细胞增殖

平板克隆实验结果显示,经过约7 d培养,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs组细胞克隆数较PBS组明显增多(t值分别为11.340和11.090,P均<0.01),且40 μg/mL ADSC-EVs组克隆数显著高于20 μg/mL ADSC-EVs组(t=4.656,P<0.01),见图3。

a:P<0.01,与PBS组比较；b:P<0.01,与20 μg/mL ADSC-EVs组比较图3 平板克隆实验检测ADSC-EVs对ID8细胞增殖能力的影响

2.4 ADSC-EVs促进ID8细胞迁移能力

细胞划痕实验结果显示(图4A),与PBS组相比,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs组细胞划痕愈合率明显升高(t值分别为3.461,11.920,P<0.05或<0.01),且40 μg/mL ADSC-EVs组划痕愈合率明显高于20 μg/mL ADSC-EVs组(t=2.740,P<0.05)。Transwell实验结果显示(图4B),与PBS组比较,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs组细胞迁移数量明显升高(t值分别为4.593和10.50,P均<0.01),且40 μg/mL ADSC-EVs组细胞迁移数显著高于20 μg/mL ADSC-EV组(t=3.328,P<0.05)。

2.5 ADSC-EVs激活AKT促进ID8细胞EMT

蛋白质印迹结果显示,与PBS组相比,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs组ID8细胞上皮标志物E-钙黏蛋白表达显著降低(t值分别为5.050,9.006,P均<0.05),而间质标志蛋白N-钙黏蛋白(t值分别为7.133,9.802,P均<0.05)和波形蛋白(t值分别为6.059,7.141,P均<0.05)表达均显著升高,见图5 A。进一步检测AKT相关蛋白的表达水平,结果显示,与PBS组相比,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs组细胞通路关键分子p-AKT表达水平显著升高(t分别为9.798,22.050,P均<0.05),而AKT表达无显著差异,见图5B。

A:划痕实验检测ID8细胞迁移能力；B:Transwell实验检测ID8细胞迁移能力；C:定量分析；a:P<0.05,b:P<0.01,与PBS组比较；c:P<0.05,与20 μg/mL ADSC-EVs组比较图4 ADSC-EVs对ID8细胞迁移能力的影响

A:蛋白质印迹实验检测EMT相关蛋白表达；B:蛋白质印迹实验检测p-AKT和AKT蛋白表达；a:P<0.05,与PBS组比较；b:P<0.05,c:P<0.01,与20 μg/mL ADSC-EVs组比较图5 ADSC-EVs对ID8细胞AKT和EMT蛋白水平的影响

3 讨论

ADSCs是一类重要的MSCs,越来越多的证据表明ADSCs在肿瘤微环境中能够调节肿瘤进展,尤其是肿瘤转移[9-10]。已有文献报道,ADSCs通过IL-6旁分泌回路促进肺癌的发生发展[11]。间质干细胞源胞外囊泡(MSC-EVs)对肿瘤的作用仍存在较大争议,其既可促进肿瘤生长、血管生成以及肿瘤转移[12],也可抑制肿瘤进展[13]。

研究发现,MSC-EVs可通过激活细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号途径,从而增强肿瘤细胞中血管内皮生长因子的表达[14]。该项研究提供了MSC-EVs可促进肿瘤生长的可能机制。本研究采用酶消化法从C57BL/6J小鼠脂肪组织中成功获得纯度较高的脂肪间质干细胞,并且成功传代。另外,采用超高速离心法提取脂肪间质干细胞上清液中的EVs,并鉴定其符合EVs一般特征。平板克隆、划痕实验以及Transwell实验结果显示,40 μg/mL ADSC-EVs组ID8细胞克隆数和迁移数量较20 μg/mL ADSC-EVs明显增多,提示ADSC-EVs能够有效地促进ID8细胞增殖和迁移。由于本实验中ADSC-EVs浓度是基于前期数据[15],因此,ADSC-EVs的其他作用浓度和作用时间仍可进一步细化研究。

在肿瘤发生转移的情况下,可由EMT介导细胞开始失去接触和黏附,导致肿瘤细胞侵袭和迁移增强[16]。EMT是多种上皮性肿瘤侵袭的关键机制,主要涉及肿瘤微环境、肿瘤细胞以及这两种成分之间的相互作用等多种信号[17]。本研究发现,ADSC-EVs处理后的ID8细胞E-钙黏蛋白表达降低,N-钙黏蛋白和波形蛋白表达升高,由此提示ADSC-EVs可能通过促进ID8细胞发生EMT,进而导致细胞迁移能力增强。AKT是PI3K的主要下游效应因子之一,能激活多种信号磷酸化底物,对细胞增殖、黏附、迁移、侵袭、代谢和存活具有重要影响。在60%以上的肿瘤中AKT信号通路呈异常激活,进而刺激肿瘤细胞增殖和血管生成。因此,该通路有望成为肿瘤治疗的靶点[18-19]；磷酸化AKT是激活这一通路的主要特征。有研究发现,MSCs来源的外泌体携带LINC01559分子可以激活AKT信号通路,从而促进胃癌的恶性程度[20]。另一项研究结果也表明MSCs来源的外泌体通过激活AKT信号通路诱导胃癌细胞EMT并赋予其干细胞特性,且MSCs来源的外泌体可能是胃癌治疗中的一个新的治疗靶点[21]。在EVs中最重要的成分之一就是外泌体,本研究发现ADSC-EVs处理后的ID8细胞AKT信号通路中的p-AKT表达明显增加,即受到明显激活。由此表明,ADSC-EVs可能通过激活AKT信号途径促进ID8细胞发生EMT,但具体作用机制有待进一步研究。

综上所述,本研究发现ADSC-EVs可能通过激活AKT信号途径促进卵巢癌ID8细胞增殖、迁移和EMT等。由此推测,肿瘤微环境中的肿瘤源MSCs可能通过分泌EVs影响肿瘤细胞生物学特性,从而促进肿瘤的发展进程。