马属动物卵巢发育研究进展

陶 力，神英超，伊敏娜，才文道力玛，王希生，任 宏，格日乐其木格，芒 来

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室，农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站，内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古呼和浩特 010018）

随着国内经济发展，马、驴产业经济价值越来越高，产业需求量也日益增长,但马属动物是一种繁殖周期较长的季节性单胎动物，其独特的繁殖生理结构排卵窝的存在使马属动物的卵巢结构不同于其他哺乳动物，因此有了不同寻常的卵巢卵泡生长发育、迁移、排卵机制。目前总体上国内外对马属动物卵巢结构、功能及机理的研究不多也不够深入，甚至在有些方面还是空白。深入了解马属动物繁殖特性规律对推动繁殖技术的开发应用具有重要意义。因此，本文对马属动物的卵巢发育相关研究进行综述，以期为国内重启马属动物繁殖机理与技术研究提供理论参考。

1 马属动物卵巢的位置与形态

马属动物卵巢在卵巢系膜的牵引下，悬浮于腰区后部，常与腰部的腹壁而相连，由卵巢系膜牵引在腰区后部的两侧下方，左侧卵巢位于第4、5腰椎横突末端下方，即左侧髋结节的下内侧；右侧卵巢一般是在第3、4腰椎横突之下，靠近腹腔顶，位置比左侧高且偏前（图1）。这一相对位置的差异在直肠检查时可带来左侧卵巢明显靠前的触感。与其他哺乳动物卵巢相同的是，马属动物卵巢会随着年龄增长、分娩次数而发生大小的改变，而且卵巢形态改变极其显著。首先，马属动物卵巢的尺寸偏大，但卵泡数量少。马卵巢沿着长轴可达5～8 cm，沿着短轴长度为2～4 cm，重达40～80 g。而中等体格的母牛卵巢平均长度为3～4 cm、宽1.5～2.0 cm、厚2～3 cm；羊卵巢较小，平均长度为1～1.5 cm、宽和厚分别为 0.8 cm和1.0 cm。其次，母马卵巢的形状与大小也随着发情周期的变化而变化，母马的卵泡直径可达到4～5 cm。而在其他马属动物如野驴或者斑马上的研究都未见报道。马属动物卵巢从胎儿期到青春期会发生实质性的形态变化，但这一现象的结构-功能-调控等仍然未知。

图1 母马生殖器官位置关系（左侧观）

2 马属动物卵巢发育

胎儿生殖系统由2个未分化的性腺、2对导管、泌尿生殖窦、生殖器结节和前庭褶皱组成，该系统主要起源于腹腔背侧的2个生殖脊，随后分化为雄性或雌性生殖系统。胎儿的性别取决于遗传基因、性腺发育以及辅助生殖器官的形成和成熟。在雌性中，穆勒氏管发育成性腺系统，而中肾管退化。雌性穆勒氏管尾部融合形成子宫、子宫颈和阴道前部。

无论雌雄，在胎儿期马性腺均是椭圆形。卵巢与睾丸的区别在于性腺器官皮质区有一层苍白的原始卵母细胞，在组织学上，两性都表现出大量的上皮样间质细胞，支撑在纤维组织框架内，无数个血管和淋巴管穿过该框架。生殖上皮在雌性胎儿中局限于一个狭窄的皮质区，而在雄性胎儿中仅限于分散的索状带。

在马胎儿生殖道发育过程中出现的一个独特特征是性腺增生，马胎儿性腺在妊娠的后半段出现快速的增生（生长）和随后的退化。在宫内期，胎儿性腺增生（睾丸或卵巢）是导致母体血清雌激素水平升高的原因。大约在妊娠第80天，雄性和雌性胎儿的性腺开始稳定地增大，在妊娠第230～260天达到最大尺寸大约350g，这是由于间质细胞肥大和发育不全所导致。此时胎儿卵巢大约是成年母马卵巢的两倍，大约占据胎儿腹腔总体积的1/3。到妊娠第270天后性腺开始退化，间质细胞开始发生明显的变性改变。妊娠第336天左右，马胎儿性腺的大小和外观都缩小到与其他家畜的初生性腺相似。但在马驹出生时，皮质和髓质的反转以及排卵窝的形成并未发生，卵巢在青春期开始时达到结构成熟。

在胎儿时期，马卵巢皮质组织是完全包裹髓质部分的，有报道称在出生小马驹卵巢中，其皮质组织几乎已被髓质组织完全包裹。目前尚不清楚母马卵巢解剖学独特特征所涉及的分子机制和这一独特性是否对应一些独特的卵巢生理学分子调控机制。

3 马属动物卵巢排卵窝

有报道称，马出生之后，在3个月左右开始出现卵巢排卵窝雏形，髓质和皮质的反转现象，6～7月龄后形成卵巢排卵窝结构。在初情期开始时，卵巢达到结构成熟期，并开始出现生长卵泡。6月龄后，直径大于10 mm的卵泡数量和大卵泡直径逐渐增加。从相对占比看，0～1月龄时髓质占整个卵巢的近90%，2～3月龄时显著减少。皮质体积在出生后逐渐增大，在8～12月龄时达到总体积的60%左右。皮质的这种显著发育与从6月龄开始观察到的生长卵泡数量和体积的增加同时发生。

在出生后的第1年，小马驹的卵巢逐渐变成豆子形状，且在卵巢门对侧，腹缘游离部有较深的凹陷，这是由于受到激素分泌停止的影响，细胞团在基质中退化。卵巢的两级生长较快，中间部位生长较慢进而形成凹陷。卵泡和卵母细胞所在的皮质区域位于器官的中心部，而结缔组织和血管位于器官的外层。生殖上皮集中在凹陷区域，由此排卵被限制在一个特定的区域，即排卵窝（Ovulation Fossa）。马属动物的成熟卵泡必须发育到足够大（一般40 mm以上）时才能通过排卵窝处破裂排卵，因此马卵巢排卵过程较长。成年母马卵巢皮质与髓质的位置与其他动物卵巢分布相反，即皮质在中央而外周由髓质包围。卵泡和黄体（Corpus Luteum，CL）位于皮质区，它们被包裹在一个致密的、血管丰富的结缔组织外膜内。马属动物卵巢卵泡对外源性促卵泡生成素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）和孕马血清（Equine Chorionic Gonadotropin，eCG）不如牛、羊那么敏感，使得马属动物卵巢卵泡从发育到成熟所需时间更长；促黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH）在卵泡发育过程中水平持续较低，造成马属动物相对排卵时间的延迟。

4 马属动物卵巢卵泡分布与排卵特征

马属动物是繁殖周期较长的季节性单胎动物，在发情季节（春季和夏季），母马的发情周期平均为21～22 d，发情期为4～7 d，间情期为14～15 d。发情周期长短受繁殖阶段和品种的影响，泌乳期发情周期是（21.2±1.8）d，非泌乳期发情周期是（22.8±1.4）d；矮马的发情周期比普通品种马大约长2 d。在乏情期卵巢原始卵泡比例较高，在间情期生长卵泡和正常卵泡的总体比例较高，但在卵泡发育中优势卵泡会抑制小卵泡发育。在繁殖季节原始卵泡的激活增加，可能与这一时期促性腺激素（FSH、LH）和表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、转化生长因子（Transforming Growth Factor Beta，TGF-）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）水平较高有关。虽然个体之间的实际卵泡数量有差异，但是成年母马卵巢在任何时候都包含大约36 000个原始卵泡和100个正在生长的卵泡。在非繁殖季节，虽有卵泡波但卵泡发育能力较弱，小卵泡占卵巢卵泡总数的2/3以上。与其他物种的卵泡密度相比，例如水牛胎儿（35.8 卵泡/mm）、小鼠（10.5 卵泡/mm）、人（53.4 卵泡/mm），母马的腔前卵泡的数量和密度极低（0.037 卵泡/mm）。随着年龄增长，卵泡密度和形态正常的卵泡百分率显著降低，5～6岁母马的正常卵泡数（97%）明显多于11～16岁母马（84%）；同时卵泡在卵巢皮质中的空间分布越来越分散，而生长卵泡较原始卵泡集中在卵巢实质中心区域，其中次级卵泡离几何中心较远，但离排卵窝较近。Gonzale等通过对未发情母马卵巢进行石蜡切片染色观察，根据卵泡发育阶段对卵母细胞和颗粒细胞形态完整性进行分析发现，与其他区域相比，卵巢最内侧区域的腔前卵泡比例最高，但中部和最外侧区域的原始卵泡和发育卵泡卵的完整率均高于最内侧区域。

发情周期内，一般有2个卵泡波，并在发情结束前1～2 d发生排卵。母马通常为单侧卵巢排卵，两侧卵巢的排卵几率不同，一般情况下左侧卵巢排卵比右侧卵巢排卵多。在排卵期母马也有可能会发生双排卵，但影响双排卵率的因素很多，如品种、繁殖状况、年龄以及发情周期的药物调控等。自发性双排卵的发生率在矮马中约为2%，在美国标准种马中约为15%、纯血马中约为25%、泌乳和非泌乳的季中分别为7%和14%。双排卵的母马有2个黄体，会有较高浓度的孕酮。当2个优势卵泡（卵泡直径＞28 mm）在同一个卵泡波中发育时，大约40%的母马都会发生双排卵，但双排卵母马的优势卵泡生长率低于单排卵母马，导致双排卵母马的排卵前卵泡直径较小，这一现象可能与马卵巢内侧空间有限相关。

与母马相比，母驴排多枚卵泡的几率更高。据报道，标准母驴排多枚卵泡的几率在5.3%～31.8%、大体型母驴则高出中小体型母驴61%，并且母驴排多卵率不受季节变化影响。张永昌等通过对2～6岁非发情季节母驴研究发现，母驴右侧卵巢排卵率高于左侧，这与张新浩等的研究结果相同。

遗憾的是，到目前为止在任何一种马属动物上没有关于卵泡选择、募集、生长、迁移相关机理性研究报道，不过也有一些关于马属动物卵巢机能相关激素分泌特征的阐述。

5 马属动物卵巢机能相关激素分泌特征

5.1 FSH、LH 刚出生的胎儿血液中几乎没有FSH与LH，随着年龄的增长会逐渐增加。与其他哺乳动物相比，马属动物体内FSH含量更高，发生排卵前成熟的条件也不同。每次排卵都伴随着一段发情期的行为特征，同时血液中孕酮含量保持在较低浓度（＜1 ng/mL）。Gastal对32匹非泌乳期矮马卵巢卵泡波研究发现，FSH在每个卵泡波发生前都有一个上升趋势，并且所有卵泡波的发育都受体内FSH刺激决定。循环LH水平在排卵前并不呈现短期高峰值，而是在排卵后排卵后1～3 d达到最高（图2）。

图2 发情周期中黄体生成素、卵泡刺激素、雌激素、孕酮和前列腺素2α浓度的变化（修改自文献[47]）

在日常马属动物培育工作中，通常会注射激素诱导排卵前成熟和排卵从而提高生产效率。早在20世纪60年代人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）就被用于诱导母马排卵，然而过渡反复注射hCG会导致多数母马的免疫反应和抗体形成。Duchamp等对母马卵巢卵泡研究发现，当发情期卵泡大于35 mm的母马注射马垂体提取物（EPE：主要是FSH和LH）时会在34 h内诱导排卵。EPE中的LH含量变化很大，在很多报道中没有准确的数据。研究表明，发情期母马经过FSH处理后可提高排卵率和胚胎回收率。而驴上的实践表明，在母驴优势卵泡直径达到35 mm时，肌肉注射hCG后76%的母驴在24～48 h排卵。唐斯嘎对60匹健康母驴使用不同剂量的hCG分别处理不同大小卵泡的母驴发现，在繁殖季节最佳诱导发情母驴排卵时间及激素剂量为卵泡发育至30～35 mm，肌注1000 IU的hCG，此时母驴排卵率高，排卵时间比较集中并且受胎率达90%。

5.2 催产素 催产素（Oxytocin，OT）是一种神经肽类激素，主要由位于视上核、视交叉上核、室旁核和弓状核的下丘脑大细胞神经元产生。储存在垂体后叶分泌囊泡中的OT进入血液后主要作用于子宫肌层，引起子宫收缩；在卵巢上催产素作用于促进孕激素的分泌和黄体退化。也有研究表明，在小鼠卵巢上催产素主要以黄体分泌，但在人、普通狨（Callithrix jacchus）和反刍动物中受排卵前LH和FSH的激增导致了有腔卵泡的颗粒细胞分泌催产素。然而，Stock等对8匹母马发情早期（1～2 d）、发情晚期（4～5 d）排卵前卵泡进行分离和培养颗粒细胞发现，母马卵巢卵泡既不是OT的来源，也不是OT作用于类固醇的靶点。与反刍动物相比，发情期母马卵巢内的OT浓度较低。Bae等通过免疫组化方法对5匹发情期母马子宫内膜活检组织研究发现，在子宫内膜浅腺上皮和腔上皮细胞内可见催产素免疫阳性染色，并在分泌上皮分泌囊中检测到OT存在。到目前为止，马是唯一被证明子宫内膜分泌OT的家畜动物。

5.3 生长因子 生长因子在排卵前成熟和排卵中是必不可少的。Müller等对18匹不同品种的健康母马卵巢使用HE染色和免疫组化研究发现，血管内皮生长因子（VEGFA、VEGFB）、血管生成素（Ang1、Ang2）和血管内皮生长因子受体（VEGF-R1、VEGF-R2）和血管生成素受体（TiE2）在排卵期卵巢中具有强烈表达。在缺乏VEGF A的情况下，血管生成素Ang2及其血管生成素受体TiE2在血管退缩中起重要作用，导致黄体溶解和卵泡闭锁。但 Bashir等对30匹发情期母马不同大小卵泡研究发现，卵泡内游离胰岛素样生长因子1、抑制素A、VEGF和催乳素浓度在排卵前最后阶段下降。此外，在马排卵前卵泡的卵泡细胞中，EGF家族成员，表皮调节蛋白和双调节蛋白mRNA显著增加。Da Silveira等在发情中期、排卵前期母马卵巢卵泡液进行研究发现，颗粒细胞中的TGF/BMP信号通路受到排卵前卵泡液中的外泌体调节，从而可能干预卵泡成熟。

6 展 望

综上所述，马属动物因物种特异性卵巢结构，其繁殖特性与卵泡分布都不同于其他哺乳动物。马卵巢卵泡在实质内的分布具有一定的规律性，不同区域之间的分布模式也明显不同。并且，马属动物卵巢卵泡数量和密度受个体、年龄、发情周期、卵泡体积的影响。目前，国内外对马属动物的繁殖特性和调控机理研究都处于起步阶段，还多属于描述性研究，关于深入机理相关信息少之又少，有必要积极研究马属动物卵巢机能和机理研究，补充国内外家畜繁殖学理论研究空缺，为建立马属动物系统有效的繁殖调控及辅助技术提供帮助。