雨生红球藻培养基筛选及诱导条件优化

张勇 李林品 吴秋瑾

摘要：目的：本文通过筛选有利于雨生红球藻营养生长的培养基，优化雨生红球藻内虾青素的积累条件。方法：选用7种培养基对4株雨生红球藻分别进行培养，同时筛选出最适于4种藻株营养生长的培养基。探究雨生红球藻在光胁迫、缺氧、高盐3种条件下诱导虾青素积累情况。结果：4个不同雨生红球藻藻株在配方A培养基中的生物量比其他6种试验培养基的生物量高1.54-6.29倍;在优势培养基配方A中，HP3的生物量最大，可达到6.03×106个/mL;HP3在缺氮的胁迫条件下，虾青素产量最高，可达到20.96mg/L，比光诱导获得的最佳虾青素产量高0.96倍，比高盐获得的最佳虾青素产量高1.53倍。结论：该研究中最适于试验藻株营养生长的培养基是配方A，当胁迫条件为缺氮9%时虾青素积累量最大。

关键词：雨生红球藻;虾青素;培养基筛选;诱导条件优化

近年来，随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，人们对健康的意识也在不断提高。水是水生生物中最重要的组成部分之一。雨生红藻具有良好的生物学特性，营养价值高及无毒等优点，是一种很有前景的生物可以利用资源。雨生红藻是自然界中广泛存在的绿藻，属于团藻目红藻科。雨生红藻又被称为湖生红藻或湖生雪球藻，被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此利用该藻菌提取虾青素具有很大的应用前景已经成为当前国际研究的热点。

虾青素是一种天然的水溶性高分子化合物，具有生物活性。主要存在于藻类、细菌以及各种植物中。在自然界中，有许多氨基酸被发现并应用到生产生活与食品领域上;虾类可以作为营养添加剂和保健品等;同时也可利用其自身所具备的酶特性来调节细胞内pH值以增强对微生物生长发育影响而发挥作用。目前在我国研究较多的是虾类中提取出来鱼粉和甲壳素两种物质作为提取虾青素原料，但这种方法对环境要求较高，且易受菌种的影响。而雨生红球藻作为提取虾青素的一种重要来源，在很多领域有着巨大价值。例如：美容化妆、健康保健、农业饲料中具有很大的价值，并且也取得了很好效果。

虾青素是一种天然的抗氧化物质，有很强的清除氧自由基能力，可以防止重金属离子在体内富集。目前我国对虾类色素主要为酚酸功能型和水溶性非挥发性合成物型两大类型;而美国、日本等国家则将其作为食品添加剂使用或直接食用。我国于20世纪80年代开始对虾青素进行了研究开发并投入生产，但随着科学技术的发展以及人们生活水平的提高，对于健康问题越来越重视起来，而水溶性非挥发性合成物型和可生物降解性物质的研究也日益受到关注。

在自然界中，红球藻是一种非常常见的生物，具有很强的生物学功能和营养价值。因为雨生红球藻能提供大量氮、磷等多种无机盐及其他微量元素。所以可以作为优质饵料;还能够有效调节水体PH值以及微生物生长繁殖环境条件等等这些作用都被充分利用起来。因此可以通过培养来筛选出优良种质资源之一，从而为海洋生态系统创造良好的生存空间与生态平衡，促进其更好地发展和保护生态环境发挥重要作用。

1 资料与方法

1.1 培养条件

目前，国内外对雨生红球藻的培养技术主要分为两种：一种是直接利用藻基质中所富含的氮元素;另一种则是从通过不同方法将各种藻类进行光合作用。在我国很多地区都有大量使用，但大多数都是以自然方式作为其生长繁殖条件。其中最常见的是人工授粉、浸种和滴灌等三种培育基形式以及混合诱导体系（即单因素培养、多因素联合培养或混成分培植），但每种培养基都有其自身的特点，且在不同环境条件下，所表现出来的效果也是不相同。

1.2 筛选时期培养

在筛选的过程中，要根据不同藻类生长所需营养成分和数量要求进行合理地选择。一般情况下，可以通过培养基形状大小、颜色以及细胞形态等方面来确定。对于一些具有特殊生理活性或某些特性的菌株来说其需要经过一定周期才能达到目的;而有些微生物则不能直接利用这些微生物产生有害物质或者对环境造成污染危害等等，因此在筛选过程中要尽可能避免分离现象发生，提高微生物的生長速度。在选择培养基时，要考虑到不同种藻类所需营养成分，以及各种因素对其影响。在实验中，雨生红球藻的培养数量为（2.00×104个/mL），培养温度为（23±1）℃，光照强度（1400-1700lx），光照时间为12h/12h（光/暗），气体条件为3%（CO2/air，v/v），存放于500mL的器皿中，器皿盛放400mL的培养基。

1.3 条件设定

首先，需要使用配方A培养HP3藻株。培养条件：温度（23±1）℃，光照强度为（1400-1700lx），光照时间为12h/12h（光/暗），气体条件为3%（CO2/air，v/v），将HP3藻株存放于1000mL的器皿中，器皿盛放700mL藻液。在培养15天后，采用离心技术（4000r/min，10min）收集藻类细胞，胁迫浓度5×105-6×105个/mL，其他条件不变。

在进行胁迫研究的过程中，本试验选取缺氮、光照以及高盐进行研究和分析，在研究光照的过程中，设置不同的光照梯度，例如：8000、10000、12000lx;另外，在研究高盐胁迫的过程中，需要在光照12000lx的基础上进行分析，在培养基A中加入NaAc，并且设置不同浓度梯度，例如：20、30、40、50mmol/L;研究缺氮胁迫的方法与高盐胁迫方法类似，也是需要在光照12000lx的基础上进行研究，将配方A中加入NaNo3原含氮量4mmol/L调整为培养基4%、8%、12%、16%，不同的胁迫条件进行对比。

1.4 色素提取与测定

色素细胞提取的方法有很多种，但是目前常用的提取剂还是水苏醇提法、碱溶酸沉凝等。碱溶液浸取：利用NaOH与碱性磷酸氢二钾进行反应生成氢氧化钠和碳酸钠来除去水中杂质离子，然后通过分光光度仪测定其吸光度;根据实验数据可以判断出pH值在4-5之间时色素细胞浓度较低甚至为零或极低于10-6mg/L即可达到培养基要求。

1.5 虾青素测定

称取0.25gNaOH，并加入4.75mL双蒸水，制得5%溶液待用;取藻液5mL，离心后沉淀，加入700ul 5%NaOH溶液和300ul甲醇，混匀，放入65℃水中15min去除叶绿素，冷却后离心收集沉淀，随后用双蒸水洗涤，加入1mL DMSO，并在65℃水中加热5min，随后冷却离心，收集上清液，反复用DMSO提取基本无色，并定容与5mL。

2 结果

2.1 培养基筛选

在筛选过程中，需要对所选培养基成分进行分析，筛选出符合实验要求的优良基因。试验首先通过单因素法确定出红球藻细胞必需生长量、pH值以及温度等条件;然后将选择好后的培养基的接种到离心管中加入适量稳定剂并设置搅拌器和压块以保证其均匀性及稳定性;其次在筛选过程中将要控制变量浓度，因为发酵液会与水发生反应生成沉淀物从而影响实验结果，因此控制变量浓度是非常重要;最后在pH值、温度以及等条件均不变时，将雨生红球藻培养基和纯化后得到的混合型生物藻类所需要添加量进行对比，筛选出符合实验要求且营养丰富、生长繁殖旺盛且具有较高生物学价值优质的培养基，并且将纯化后得到的混合型生物藻类所需要添加量控制在10-12mg/L，且pH值、温度及等条件均不变时，分别加入5g和7ml这两种培养基中进行培养。HP1细胞数目最多为6.44×106个/mL。改良后，细胞数目最低为1.73×106个/mL;HP2细胞数目为5.44×106个/mL，OHM细胞数目2.56×106个/mL;HP3细胞数目最多为7.19×106个/mL，是改良MCM后的7.29倍。如图1所示。

2.2 虾青素诱导

虾青素是一种天然的绿色抗氧化剂，能够抑制细胞中各种核酸和蛋白质在细胞膜上发生氧化反应。其主要来源为水溶性氨基酸、肽键或其他化合物。由于这种物质具有很强的生物稳定性，所以可以利用这个特性来进行筛选培养基成分及单糖含量较高或者不溶于水中等多种酶系而被广泛使用;另外还能与亚硝酸根离子结合形成抗营养因子和降低细胞的低聚物诱导生长发育，提高细胞的抗氧化能力。然而，在实际生产操作中，有许多因素都影响了其结果。如pH、温度和光照等;而本实验以水溶性生物碱作为培养基成分并通过正交试验筛选出雨生红球藻为诱饵进行筛选及诱导条件优化是非常具有现实意义的方法之一。

通过研究表明，光照强度10000lx下，类胡萝卜素最高为12.10mg/L;10000lx条件下，高盐9d后，30mmol/L NaAc类胡萝卜素最高为8.91mg/L，50mmol/L NaAc最低为5.87mg/L;10000lx下，缺氮9d后，类胡萝卜素梯度为10%（21.35mg/L）、5%（20.24mg/L）、15%（17.51mg/L）、20%（13.13mg/L）。如图2所示。

3讨论

目前，对雨生红藻的研究主要集中于其生物特性以及环境适应性等。生物学方面：在生物界中，许多学者都发表了大量关于如何利用与开发和提高对植物生长影响因素进行试验或研究的理论论文、实验报告及相关文献;而对于一些已经有一定规模并且具有代表性并能取得较好经济效益且可以应用于实际生产应用的雨生红球藻资源来说，其研究也是非常重要，且有很高的研究价值。本实验以雨生红藻为材料，利用pH法和红外光谱等方法，通过单因素试验、正交试验的方式来确定最佳培养基。结果表明：在影响雨生红球藻生长环境条件（温度、光照强度及氮磷比）中选取三种最为适宜的初始浓度;其次是梯度处理下不同时间段光照度对其生物量以及产量均有很大程度上不同变化;最后则是从pH值和红外光谱反应得到最适酸碱度，从而达到比较好地效果，即pH值在0-9时，其生物量最高，红外光谱反应则为最适偏酸碱度。通过对不同初始浓度和时间下的雨生红球藻培养基进行对比分析得出结论：当pH大于8且氮磷比小于4時才会出现较好地变化。

在雨生红藻培养基中，最重要的就是筛选，而如何选择合适的培养基的成为了一个难点。首先是要对不同浓度（如：磷、钾等）和pH值下生长良好并符合要求较高温度和光照强度大且无毒性物质污染水体。因为水本身具有弱碱性或强酸性。所以可以通过改变氮肥比例或者在一定条件下使pH降低来达到去除水中含有的铅离子，使水体中的铅离子浓度降低;其次是对不同pH值下培养基的优化。通过实验模拟研究得出最适合雨生红率生长条件;最后就是根据实验结果分析出合适量与PH梯度相同时间段来确定其最佳操作方法及参数范围，为以后雨生红率的生长和培养提供理论依据。

在自然界中，水藻生物作为一种重要的植物，是其主要生长环境。由于各种原因导致雨生红球藻不能大量繁殖。因此要将其利用起来就要有一定量的培养基进行筛选和培育以适应各种不同种类与数量以及所需氮、磷、钾等营养元素含量丰富多变而具有较高产量价值且适合工业化生产条件要求（如：高温下发酵）;其次，还可以在合适季节对水藻进行处理使其能够快速生长发育。根据研究结果表明，雨生红藻可以通过生物法、化学合成以及物理处理三种途径来培养，其中最主要的方式是利用其生长条件和营养元素等方面进行筛选，筛选得到最佳培养基，从而为其后续的研究奠定基础，使其能在实际生产中发挥更好作用。

虾青素是一种在自然界中含量丰富、具有生物活性的天然高分子化合物，其广泛存在于植物当中，在水产品加工和医药领域有着重要意义。然而随着科技发展及人类生活水平提高以及食品安全问题的日益突出使得人们对食物健康质量提出了越来越高标准。而超强抗氧化性是指能清除自由基并防止细胞衰老或破坏细胞结构从而达到延长寿命等一系列要求;另外还包括具有很强耐受胁迫作用、不改变营养成分，且对人体无害的特性。因此，超强抗氧化性是食品安全问题中最重要因素之一。而藻酸盐就是其中一种天然生物活性成分，在自然界和生活当中都有广泛存在的应用。

虾青素是一种广泛存在于自然界的天然高分子化合物，含有大量氨基酸、维生素等，具有一定生物活性。在很多领域都有应用。近年来人们对其提取分离纯化方法进行了研究和探索性探讨发现：用超滤法、水相萃取技术处理得到的鱼鳞状海藻红球蛋白可用于食品行业中;利用虾青素来作为抗氧化物质添加剂应用于化妆品行业，使之达到安全标准并实现工业化生产;利用超滤技术可用于提取生物碱，使其在化妆品中的应用更广。

4 总结

近年来，随着生物技术的迅捷发展，在水环境中，各种类型藻类不断地应运而生。目前我国很多地区都建立了大量的人工湿地。但是由于缺乏相应配套设施和管理体制等因素影响下无法大面积种植雨生红球藻种源及产量;其次是由于雨生条件对生物材料生长所造成阻碍导致许多种类细菌繁殖速度慢、质量差甚至死亡现象严重等等一系列问题也制约着其生产应用，因此，如何提高雨生红球藻的产量和质量成为当前急需解决的问题，而诱导条件则是实现其产量和质量的关键，是实现其产量和质量的关键。

参考文献：

[1]孙双，张婷，方琰，胡莎莎，黄思琦，叶其然，兰利琼，卿人韦.雨生红球藻高产虾青素的培养条件优化[J].现代食品科技，2021，37（06）：98-107.

[2]赫春青，陈开阳，师三媛，肖冬光，范志华，刘智永，陈方见.提高雨生红球藻细胞密度发酵工艺的优化研究[J].食品研究与开发，2021，42（01）：166-171.

[3]李芸，刘发龙，王巧晗，刘岩，李景玉，宫庆礼.藻际可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2020，50（07）：44-55.

作者简介：张勇（1971—  ），男，汉族，上海人，博士，高级经济师，研究方向：雨生红球藻产业化。