注射用糜蛋白酶溶解后稳定性及雾化粒径考察*

王 玮，包建安，刘睿娟，沈国荣，王 永，朱建国，缪丽燕

（苏州大学附属第一医院药学部，江苏 苏州 215006）

雾化吸入疗法已成为治疗呼吸系统疾病重要的辅助手段之一。国内常使用注射用药物进行雾化吸入，与目前雾化吸入治疗相关指南的推荐意见不一致［1-2］。不建议使用注射用制剂进行雾化治疗的主要原因：1）无法保证注射液雾化后颗粒的均匀度，粒径难以控制在0.5～10.0μm间，无法最大限度地沉积于气道和肺部；2）部分注射液为强酸或强碱溶液，雾化后产生的刺激性气体会导致气道痉挛引起呼吸困难，如注射用盐酸氨溴索不能与pH＞6.3的0.9%氯化钠注射液配伍使用［3］；3）尚不明确注射液中辅料的安全性，部分药物中的防腐剂等辅料雾化后有诱发哮喘的风险。因此，测定临床常用注射用药品制成雾化制剂后的pH、含量及雾化粒径，可为临床安全使用雾化疗法提供有效参考。本研究中建立了测定注射用糜蛋白酶溶解后含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，并考察了注射用糜蛋白酶雾化吸入溶液（简称雾化溶液）的稳定性和雾化粒径分布。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Aglient1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Spraytec STP2000型激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；FE20型实验室pH计，XS105DU型分析天平（精度为千分之一），均购自瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；DFM 2000型流量计（英国Copley Scientific公司）。

1.2 试药

注射用糜蛋白酶（上海上药第一生化药业有限公司，批号为1707037，规格为每支4 000 IU）；0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号为9J83B2）；灭菌注射用水（国药集团容生制药有限公司，批号为1905517）；糜蛋白酶对照品（批号为C2160000，纯度≥1 000 U/mg），三氟乙酸（批号为B1927051），均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；无水乙醇（分析纯，广东光华化学厂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Grace 214TP C4柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液（A）-0.09%三氟乙酸乙腈（B），梯度洗脱程序见表1；流速：1.00 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。精密量取空白对照溶液（0.9%氯化钠注射液）、对照品溶液、供试品溶液各10μL，进样测定，结果在此色谱条件下，糜蛋白酶峰形对称，阳性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.1.2 溶液制备

取糜蛋白酶对照品100 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用0.10%三氟乙酸水溶液溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为10.0 mg/mL的对照品溶液。取样品10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用0.10%三氟乙酸水溶液溶解并定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得质量浓度为1.0 mg/mL的供试品溶液，于4℃保存。取样品10 mg，精密称定，分别用0.9%氯化钠注射液及灭菌注射用水稀释成质量浓度为2.0 mg/mL的雾化溶液，于4℃下避光保存。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品溶液适量，加水稀释成糜蛋白酶质量浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0 mg/mL的系列对照品溶液，分别精密量取对照品溶液200μL，各加入0.10%三氟乙酸水溶液300μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以糜蛋白酶质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.77X-29.78（R2=0.999 8，n=6）。结果表明，糜蛋白酶质量浓度在0.20～2.00 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取同一对照品溶液适量，加水稀释成糜蛋白酶质量浓度分别为0.2，0.6，1.0 mg/mL的待测溶液。按2.1.1项下色谱条件于1 d内连续进样5次，日内精密度的RSD为0.17%（n=5）；取待测溶液连续进样测定3 d，每天3次，日间精密度的RSD为0.70%（n=9），表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密量取供试品溶液适量，加水稀释制备待测溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果供试品溶液中糜蛋白酶的平均含量为0.61 mg/mL，RSD为2.00%（n=5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取供试品溶液适量，置4℃恒温自动进样器中，分别于放置0，1，2，4，6 h时进样分析，按外标法以峰面积计算样品含量。结果样品中糜蛋白酶的平均含量为98.59%，RSD为1.14%（n=5），表明待测样品在4℃下放置6 h稳定。

回收试验：取质量浓度分别为0.2，0.6，1.0 mg/mL的对照品溶液适量，各3份，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算回收率。结果平均回收率为（100.81±2.47）%，RSD为2.45%（n=9）。

2.2 稳定性考察

取样品10 mg，精密称定，共2份，置10 mL容量瓶中，分别用0.9%氯化钠注射液与灭菌注射用水溶解并定容，摇匀，于4℃下避光保存。按2.1.1项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算，分别考察0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 h时样品的性状、pH、含量、降解率，重复4次，测试雾化溶液的稳定性。结果样品用灭菌注射用水和0.9%氯化钠注射液稀释后，6 h内均呈澄清状态，且2 h内含量较稳定，pH、含量、降解率测定结果见表2。

表2 不同溶剂配制下雾化溶液的pH、含量、降解率测定结果（n=4）Tab.2 Determination results of p H，content and degradation rate of aerosol inhalation solution prepared with different solvents（n=4）

2.3 雾化溶液粒径测定

空气流量计的参数设置：空气流速为15 L/min（±5%），相对湿度为40%～60%，介质折光率为1，颗粒折光率为1.33。将5 mL雾化溶液（质量浓度为2 mg/mL）分别装入不同的喷雾器中，与人工喉相连，测试雾化粒径大小，15 min后观察到雾化溶液无残留，停止采样，每组重复4次，得到累积分布分别为10%，50%，90%时对应的粒径，即Dv（10），Dv（50），Dv（90）。结果见表3。以径距（span）代表样品粒径分布宽度，span=［Dv（90）-Dv（10）］/Dv（50）。一般span＜1，小颗粒较少。本研究中，2种雾化方法span均有较大的跨度，但灭菌注射用水配制的雾化溶液span的跨度显著小于0.9%氯化钠注射液雾化溶液（P＜0．05）。

表3 不同溶剂配制下雾化溶液粒径考察结果（X±s，μm）Tab.3 The particle sizes of aerosol inhalation solution prepared with different solvents（X±s，μm）

3 讨论

2015年版《中国药典（二部）》中注射用糜蛋白酶质量标准仅有效价测定项，无纯度检查项，难以确切控制药物的含量，可能存在用药安全风险［4-5］。预试验中，采用效价测定法测定注射用糜蛋白酶的含量，但浓度测定误差较大。虽然HPLC法测定糜蛋白酶含量时，色谱图中样品峰基线稳定，且与杂质峰分离效果好，但用时较长，不适合大样本分析［6］。本研究中通过调节梯度洗脱的时间及流动相比例，建立了快速测定注射用糜蛋白酶含量的RP-HPLC法，测定时间缩短为22 min。

此外，目前研究多集中在糜蛋白酶药理学性质及临床用药，尚未见药物配制稳定性及雾化后体内分布的报道［7-9］。稳定性考察发现，注射用糜蛋白酶在0.10%三氟乙酸流动相中，4℃下6 h内可保持稳定。对于痰多、黏稠的患者，雾化吸入糜蛋白酶溶液可降低痰液黏弹性，加速患者康复［10］。由表2可知，用灭菌注射用水制备的雾化溶液放置6 h，pH为6.02，接近中性，刺激性较小，2 h内平均降解率低于10%，较0.9%氯化钠注射液雾化溶液稳定。雾化吸入疗法主要是应用雾化吸入装置使药液形成粒径为0.01～10.00μm的气溶胶微粒，患者吸入后能较好地沉积于气道和肺部。雾化过程中，影响药物沉积的主要因素包括微粒性质、呼吸道几何结构、呼吸模式，微粒粒径大小及分布，上述因素决定了雾化药物在呼吸系统中的沉积部位和沉积量，影响药物疗效［11］。有效雾化颗粒直径一般为0.5～10μm，其中5≤粒径≤10μm主要沉积于口腔与咽喉部位，3≤粒径＜5μm主要沉积于肺部，粒径＜3μm有50%～60%沉积于肺泡［12］。临床中不推荐注射用糜蛋白酶用于雾化治疗［1，13］，但该药用于雾化可有效防止痰栓形成，加速患者康复。由表3结果可知，注射用糜蛋白酶在0.9%氯化钠注射液及灭菌注射用水中雾化效果均可达到预期，且均可到达肺部，发挥溶解痰栓的作用。此外，《欧洲药典9.0版》指出15 L/min的流速是最接近正常人体的呼吸流速，则本研究中采用15 L/min［14］。但也有研究指出肺炎患者的吸气能力比正常人差，应在低于正常人呼吸流速的情况下测定雾化粒径［15-17］，后期将进一步加以研究。