骨转移肺鳞癌的血浆长链非编码RNA差异表达分析与MIR4697HG预测价值初步验证

李 孛， 王小勇， 郑冰倩

肺癌是中国最常见的恶性肿瘤和肿瘤相关性死因[1]，其中肺鳞癌(lung squamous cell cancer，LUSC)约占2/3。60%以上的肺癌患者初诊时已处于中晚期[2]，常发生骨转移，约占35%[3]。肺癌骨转移的骨骼相关事件，如病理性骨折、骨痛、脊髓压迫症状和高钙血症等，严重降低患者的生活质量[4]。双膦酸盐的使用虽然在一定程度上延迟了骨骼的破坏，但因无法促进新骨骼形成，治疗效果并不理想[5]。因此，寻找与肺癌骨转移相关的无创标记物，以预测LUSC的骨转移风险和预后，并探讨其机制，可为肺癌骨转移的治疗提供理论参考。

基于高通量测序技术进行分子靶标筛选，寻求肺癌骨转移的个体化标记物，是目前的热点议题[6]。但关于该领域的研究均基于组织水平，尚缺乏无创血浆标记物的高通量测序探索。此外，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200 nt的非编码RNA，可从表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等水平参与癌症的发生。目前有较多关于lncRNA在肺癌中预后预测价值的探索[7]，但尚无关于lncRNA在肺癌骨转移中的相关组学研究。本研究首先通过血浆lncRNA测序筛选LUSC骨转移的相关无创分子标记物，并选择MIR4697HG进行验证，通过生物信息学手段初步鉴定其预后预测价值和生物学机制。

1 对象与方法

1.1 对象 回顾性收集2014年2月-2020年10月就诊的LUSC患者58例，男性41例，女性17例，中位年龄52岁(24～76岁)，美国东部肿瘤合作组(eastern cooperative group, ECOG)评分均<2分，无骨转移41例，骨转移17例，其中无骨转移组均无其他部位转移；骨转移组5例为单处骨转移，12例为多处骨转移，最常见转移部位为肋骨(8例，47.1%)，合并其他部位转移13例(76.4%)。纳入标准：(1)经病理确诊LUSC；(2)血浆标本质量合格。排除标准：(1)其他病理类型的肺癌；(2)合并多原发癌或其他恶性肿瘤。

1.2 方法

1.2.1 试剂和设备 基因芯片[nrStarTMHuman Functional lncRNA PCR Array，中国数谱(上海)生物科技有限公司]；全波长酶标仪(Multiskan Sky，美国Thermofisher公司)；实时定量PCR仪(MA-6000，中国苏州雅睿生物技术有限公司)；反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)、荧光定量试剂盒(SYBR Premix ExTaq II Kit)(日本TaKaRa公司)。

1.2.2 lncRNA芯片检测和RT-PCR验证 采集患者清晨空腹外周血5 mL作为血浆标本加入离心管。首先选择3对骨转移与非骨转移标本进行lncRNA测序，4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，吸取上清转至1.5 mL EP管中，按照TRIzol试剂盒说明书提取血浆样本总RNA，并定量测定RNA浓度和纯度。当OD260 nm/OD280 nm为1.9～2.1时进行进一步分析，差异lncRNA的标准为P<0.05。进一步挑选MIR4697HG在血浆样本中进行qRT-PCR验证。根据反转录试剂盒和荧光定量试剂盒说明书逆转录提取RNA后进行RT-PCR，以GAPDH为内参。

1.2.3 TCGA数据库分析和预测 登录GEPIA在线网站，对TCGA数据库进行可视化分析，观察MIR4697HG在人体组织中的表达分布情况，并进行泛癌症分析，观察MIR4697HG在不同癌症中的差异表达情况，最后验证MIR4697HG在LUSC中的预后预测价值，并基于TCGA矩阵筛选与MIR4697HG存在共表达的基因(前200名)进行靶基因预测。

1.2.4 lncRNA靶基因信号通路分析 采用DAVID Bioinformatics Resources 6.8数据库对MIR4697HG的共表达基因进行信号通路富集分析[8]。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验。通过绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)，判断血浆MIR4697HG表达水平对骨转移LUSC的预测效能，并通过计算约登指数，寻找血浆MIR4697HG预测肺癌骨转移的最佳截点。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线图，并采用log-rank法进行比较。P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 lncRNA测序 对3对骨转移与非骨转移标本进行lncRNA测序，共筛选出456个差异lncRNA(表1)，其中上调lncRNA 156个，下调lncRNA 300个。选择P值最低的MIR4697HG(log2FC：-3.331 52)进一步分析。

表1 血浆lncRNA表达谱差异分析(排名前10位的基因)

2.2 MIR4697HG的低通量外部验证 qPCR验证结果提示，无骨转移组的血浆MIR4697HG表达水平高于骨转移组[(0.13±0.04)vs(0.08±0.03)，P<0.000 1，图1]。ROC曲线分析提示，血浆MIR4697HG表达水平预测骨转移的曲线下面积为0.876，灵敏度为92.7%，特异度为76.5%，阳性预测值为79.8%，阴性预测值91.3%，计算约登指数决定最佳截点为0.087 9(图2)。

图1 血浆MIR4697HG在骨转移和非骨转移组的差异表达Fig.1 The differential expression of plasma MIR4697HG between bone metastasis and non bone metastasis groups

图2 血浆MIR4697HG预测肺癌骨转移的ROC曲线分析和最佳截点设置Fig.2 ROC curve analysis and optimal cut-off point setting of plasma MIR4697HG in predicting bone metastasis of lung cancer

2.3 MIR4697HG在LUSC的预后价值 采用TCGA数据库进行MIR4697HG的组织分布和泛癌症分析(图3)，MIR4697HG主要表达在正常脑组织和结直肠组织中，在正常肺组织和乳腺组织中亦有中度表达。泛癌症分析发现，MIR4697HG在多种癌症中呈低表达，可能行使广泛的抑癌基因角色。

图3 MIR4697HG的组织分布和泛癌症分析Fig.3 Tissue distribution and Pan-cancer analysis of MIR4697HG

选择TCGA数据库中的LUSC数据集进一步分析发现，随着LUSC分期的升高，MIR4697HG的表达逐渐下降(图4)，且低表达的肺癌患者，无病生存率和总生存率均较低(图5)。

图4 MIR4697HG在不同肺鳞癌分期的表达模式Fig.4 Expression pattern of MIR4697HG in different stages of lung squamous cell carcinoma

A：无病生存率；B：总生存率。图5 MIR4697HG高表达组和低表达组的生存分析Fig.5 Survival analysis of MIR4697HG high expression group and low expression group

2.4 MIR4697HG的生物学功能初探 通过共表达基因寻找MIR4697HG的靶基因，前200名基因中共70个编码基因，运用DAVID数据库对MIR4697HG的靶基因进行信号通路分析，结果提示主要富集于细胞外基质受体相互作用信号通路上(P=0.003 4)。

3 讨 论

骨转移是LUSC最常见的转移部位之一，总体预后较差。一项纳入356例肺癌患者的回顾性分析发现，骨转移最常见的部位是肋骨，其中位生存率仅12.5个月，1 a生存率仅为50.8%，而肺癌骨转移数量、ECOG评分、双膦酸盐治疗以及血清钙、血清乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶与预后显著相关[9]。寻找LUSC骨转移相关的无创预测标记物和预后预测标记物，能够筛选高危患者，进行个体化干预。

Zhang等[10]在组织学水平鉴定了LUSC的差异表达lncRNA、miRNA和mRNA，有助于研究肺癌发生的分子机制和探索预后生物标志物或治疗靶点。本研究通过血浆lncRNA组学分析，高通量鉴定LUSC骨转移相关的lncRNA，共筛选出456个差异lncRNA，有助于为今后相关分子标记物的研究提供参考。一些排名靠前的标记物lncRNA分子，如TM4SF1-AS1(排名第2)，已被证实能够激活PI3K/AKT信号通路，促进肺癌细胞的迁移和侵袭[11]；而ABHD11-AS1(排名第3)可被m6a转移酶METTL3所诱导而上调，从而促进非小细胞肺癌的Warburg效应[12]。

根据组学结果，本研究进一步采用MIR4697HG进行扩大样本低通量验证。由于回顾性研究难免存在病例脱落现象，纳入本研究的58例患者虽为非连续病例，但患者的基线资料(年龄、性别、ECOG评分、骨转移率等)与既往文献报道相仿，具有代表性[4]。本研究进一步证实无骨转移组血浆MIR4697HG的表达水平高于骨转移组。ROC曲线分析提示，血浆MIR4697HG表达水平预测骨转移的曲线下面积为0.876，灵敏度92.7%，特异度76.5%，阳性预测值79.8%，阴性预测值91.3%，具有良好的预测价值和临床应用前景。目前尚缺乏MIR4697HG在肺癌中的体外研究。Mao等[13]和Bady等[14]发现，RAD21抑制肿瘤抑制因子MIR4697HG的转录，导致胶质瘤的发生，且RAD21表达与胶质瘤的预后相关。TCGA数据库分析发现，MIR4697HG在肺组织中中度表达，其低表达与肺癌患者不良肿瘤学预后有关，提示MIR4697HG在LUSC中扮演抑癌基因角色。进一步的泛癌症分析发现，MIR4697HG是一个普遍抑癌分子。

本研究的靶基因信号通路分析发现，MIR4697HG的靶基因主要富集在细胞外基质受体相互作用信号通路上。细胞外基质受体相互作用信号通路是多种癌症，包括胃癌[15]、肺癌[16]、肝癌[17]等进行细胞迁移和转移的重要过程。虽然目前尚无关于MIR4697HG在肺癌中作用机制的相关研究，但Zhang等[18]的体外研究发现，MIR4697HG敲除可导致基质金属蛋白酶-9、磷酸化ERK和磷酸化AKT水平下降，提示MIR4697HG可通过影响细胞外基质，调节卵巢癌细胞的迁移和转移过程。但因本研究样本量小，故该结论需要设计优良的大样本研究进一步验证。

综上，本研究通过本中心血浆样本和TCGA数据库，筛选了血浆MIR4697HG作为LUSC的预测因子和预后因子。