网钙蛋白2 的结构与功能及其在疾病中作用的研究进展

刘隆福 综述，彭宁，蒋铁建 审校

1. 湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021；2. 中南大学湘雅医院内分泌科，湖南 长沙 410008

1993 年，OZAWA 等［1］于小鼠畸胎瘤细胞系中发现了网钙蛋白（Reticulocalbin，RCN），随后，从人移行细胞癌细胞系中克隆出RCN 基因［2］，并归类于Cab45 ／Reticulocalbin ／ERC45 ／Calumenin（CREC）蛋白家族。有研究表明，RCN 基因的纯合缺失对小鼠具有致命作用［3］，推测RCN 参与哺乳动物的细胞分泌过程［4］，在维持细胞正常生理活动等方面不可或缺 。 CREC 家 族 由 RCN1、RCN2、RCN3、SDF4 和CALU 5 个不同的基因编码，其结构均包含数个与Ca2+结合蛋白相互作用的结构域，即EF-hand 结构，该结构特异性高，亲和力强，主要表达于内质网和高尔基体中。CREC 蛋白不仅参与细胞代谢，且在多种疾病中表达失调，表明其可能在疾病的发生发展中发挥重要作用。RCN2 是一种低亲和力Ca2+结合蛋白，又称内质网55 kDa Ca2+结合蛋白［Ca2+-binding protein of 55 kDa，ERC-55（ER）］、维生素 D 受体相关因子1（VDR associated factor 1，VAF1）、E6 结合蛋白（E6-binding protein，E6BP）或 Taipoxin 相关 Ca2+结合蛋白-49（Tai-poxin-associated Ca2+-binding protein-49，TCBP-49）［5-9］，严格定位于内质网中。编码 RCN2 的人类基因位于染色体15q22. 33-q24. 1［10］，长度约2 300 bp，主要由2 个外显子和1 个含有375 个碱基的内含子构成的单拷贝基因，可转录为含1 900 个碱基的mRNA［4］。RCN2 具有广泛的免疫调节活性，参与维持氧化还原稳态、调节细胞周期及凝血过程等生理活动，尤其与某些疾病的恶性转化相关［11］。本文就RCN2 的结构与功能及其在恶性肿瘤、心血管疾病、骨质疏松及肌少症中作用的研究进展作一综述。

1 RCN2 的结构与功能

RCN2 蛋白相对分子质量约为55 000，编码含317 个氨基酸的前体蛋白，其结构主要由1 个N-末端的信号序列、6 个EF-hand 结构和 1 个His-Asp-Glu-Leu（HDEL）羧基末端四肽序列构成。在细胞培养过程中约50% HDEL 缺失突变体会将RCN2 逐渐的分泌至培养基中，野生型未检测到RCN2 的分泌［12］，推测HDEL 是内质网驻留信号序列，可通过与内质网膜上相应受体识别结合而不被转运。经X衍射法分析小清蛋白（Parvalbumin，PV）的三维结构，发现了一种特殊的螺旋-环-螺旋结构，即EF-hand结构，这种结构由2 个垂直的α 螺旋和1 个位于螺旋之间的含有11~14 个氨基酸的Ca2+结合环构成［13］。对人类染色体组进行分析，目前已发现含EF-hand 结构的蛋白242 个［14］，从其他物种中确定具有EF-hand结构的蛋白超过 600 个［15］。EF-hand 结构在 Ca2+结合蛋白中较常见，包含钙调蛋白（Calmodulin，CaM）、PV、肌钙蛋白 C（Troponin C，TnC）、S100 蛋白家族等。RCN2 中的第4 个EF-hand 结构序列含有一段特殊肽，可与E6 癌蛋白结合，增强人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）活性，从而介导宫颈癌细胞的恶性转化。

Ca2+是机体进行各种生理活动不可缺少的离子，可保持细胞膜的完整性和通透性，参与神经冲动传导及肌肉伸缩与舒张等过程，还与凝血过程、神经递质的合成及释放、激素的合成与分泌相关，介导细胞信号转导及基因表达，Ca2+也是构成骨骼的主要成分。RCN2 通过识别Ca2+信号，聚集基质相互作用分子 1（stromal interaction molecule 1，STIM1），使其与钙释放的激活型钙调节剂1（calcium release activatedcalcium modulator 1，Orai1）相互作用形成复合物，进而调控钙池调控钙离子通道（store-operated channels，SOC）的活性，维持细胞内的钙稳态［16］。细胞内Ca2+浓度的稳定性及内质网功能的完整性均依赖SOC的调控［17］，STIM1 和 Orai1 是 SOC 的传感器，在其活性功能发挥过程中不可或缺［18-20］。因未折叠蛋白在内质网中积累时，RCN2 表达未出现明显上调，因此虽RCN2 与内质网Ca2+依赖事件有关，但可能不直接参与蛋白质折叠加工过程。RCN2 除了调控Ca2+稳态外，还可介导蛇毒Taipoxin 毒性的发挥及调节小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）的分化。

神经毒素Taipoxin 经色谱分离、纯化并鉴定获得TCBP-49，这是一种与RCN2 结构具有同源性的蛋白，含有EF-hand 结构和高亲和力钙结合环，表明其可介导蛋白质折叠、分类和膜运输的钙调节。研究表明，由于TCBP-49 改变了寡聚糖结构、磷脂酶活性及Taipoxin 毒性，从而影响了Taipoxin 在阻止突触囊泡循环中的作用［9］。神经元五肽1（neuropentin 1，NP1）、NP2 和神经元五肽受体（neuropentin receptor，NPR）均是通过与Taipoxin 相互作用而鉴定得到的新蛋白质家族成员［21］，可能在突触形成和重塑过程中发挥作用。NP1 和NP2 以高阶多聚体的形式存在，与Taipoxin 和TCBP-49 相互作用。NPR 本身不与 Taipoxin 或 TCBP-49 结合，但能与 NP1、NP2 形成异五聚体，其复合物 NP1·NPR 和 NP2·NPR 异多聚体从细胞膜释放，再通过NP1 或NP2 亚基结合TCBP-49［22］。NP1、NP2 对 Taipoxin 层析柱的富集表明，该途径不仅激活了Taipoxin 毒性，同时也提供了其介入突触的机制。

ESC 不仅能够分化为所有细胞类型，还可在体外无限自我更新。尽管这些特性使ESC 于再生医学领域备受青睐，但其衍生物的应用尚存在许多障碍。丝氨酸 ／ 苏氨酸激酶 40（serine ／ threonine kinase 40，Stk40）可激活 Erk ／ MAPK 通路，诱导小鼠 ESC 向胚外内胚层（ExEn）分化［23］。RCN2 作为一种发育调节蛋白，是细胞外分化所必需的，在早期小鼠胚胎外显层的细胞质中特异性表达。有研究表明，Stk40与RCN2 直接相互作用，在ESC 分化过程中，细胞质 RCN2 与 Stk40 平行上调，均能激活 Erk1 ／ 2；若在小鼠ESC 中诱导ExEn 分化，敲低RCN2，可阻止Stk40激活 Erk1 ／ 2 和 ESC 分化，表明 RCN2 在 Stk40 作用机制下游起作用［23］。RCN2 可能是体外ESC 和体内早期发育中ExEn 分化中的重要蛋白，但Stk40和RCN2 刺激 Erk1 ／ 2 的作用机制尚未明确。

2 RCN2 在恶性肿瘤中的作用

近年，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，但多数仍缺乏有效的治疗手段，且疾病的发病机制较复杂，已成为人类死亡的主要原因之一［24］。RCN2 在人类恶性肿瘤中发挥重要作用，可促进肿瘤细胞的增殖和转移。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在多种肿瘤类型中过度表达，可促进肿瘤的发生发展［25］，如在肝细胞癌中，EGFR 通路的过度激活会导致癌症不可控的增殖和远处迁移［26］。RCN2 基因敲低或敲除可在体内外抑制肝癌细胞的增殖，还可能通过激活EGFR-ERK 通路诱导G1 ／ S期阻滞和下调cyclinD1 的表达，从而显著抑制肝癌细胞的增殖［27］。有研究显示，RCN2 基因敲除对裸鼠EGFR 磷酸化、Ki-67 表达和肿瘤生长均有抑制作用，表明RCN2 可能通过调节EGFR-ERK 通路的激活在肝癌细胞增殖和肿瘤生长中发挥关键作用，而RCN2 的表达上调与肝细胞癌患者预后较差相关，并与其增殖、侵袭和迁移具有重要意义［28］，提示RCN2 是肝癌的一个潜在治疗靶点，但对其他肿瘤中EGFR 通路的影响尚需进一步研究［27］。WANG等［29］研究表明，RCN2 在直肠癌组织中表达水平明显高于邻近癌旁组织，敲除RCN2 基因后，可显著降低肿瘤细胞的增殖；经统计分析，RCN2 的表达与结直肠癌患者的无病生存率和整体生存率相关，且其高表达是预后不良的独立预测指标，提示RCN2 可能促进肿瘤的增殖生长。高危型HPV持续感染是引发宫颈癌的主要因素之一，目前，已发现有150 多种类型HPV，与宫颈癌的恶性转化密切相关的是高危型 HPV16 和 HPV18［30］。E6 和 E7 蛋白是HPV 基因组编码的主要致癌蛋白，其在细胞内的表达是引发癌变的关键，E6 蛋白通过与p53 蛋白相互结合，使其泛素化降解失去正常功能，进而抑制细胞凋亡，导致肿瘤发生［31］，且E6 蛋白还能通过多种机制激活 EGFR 信号通路［32］。RCN2 与 HPV 感染相关的恶性转化有关，与E6 相互作用的RCN2 位点按照序列FVSLEEFLGD 映射至第4 个EF-hand结构中的第 2 个 α 螺旋中［33］，RCN2 与 HPV 编码的E6 致癌蛋白相互作用后使细胞向恶性转化，促进肿瘤血管生成，E6 蛋白突变体的转化活性与其结合能力相关［8，34］。另有研究表明，感染 HPV16 的细胞RCN2 转录水平明显高于未感染的细胞，感染更具侵袭性的HPV18 的细胞中，RCN2 的转录水平更高［35］；表达Her2 癌基因的小鼠乳腺肿瘤体积的增加与RCN2 的转录水平呈线性相关［36］。

另外，多项研究证实，CREC 蛋白家族的RCN1在肾细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌等多种实体肿瘤中均显著升高，并可促进这些恶性肿瘤的侵袭及转移［37-41］。HOU 等［42］报道，RCN3 可能参与非小细胞肺癌的发生发展。RCN2 虽然参与恶性肿瘤的增殖生长，但其在恶性肿瘤中的作用机制尚未明确，仍需进一步深入研究。

3 RCN2 在心血管疾病中的作用

近年，高血压的患病率呈逐年上升趋势，是全球常见的慢性心血管疾病［43］，随着疾病的进展可导致血管破坏，进而引发一系列严重的并发症，致死率较高。5% ~ 10%的高血压是继发性的，如肾实质性高血压、肾血管性高血压、内分泌高血压和其他高血压等，其他高血压患者目前尚无明确的病因，称为原发性高血压［44］。因此识别新的致病基因和途径有助于更好地了解高血压的发病机制及制定预防及治疗策略。有研究表明，敲除小鼠RCN2 基因后，小鼠基础血压降低，血管紧张素Ⅱ诱导的高血压减弱，其中小鼠颈动脉对乙酰胆碱介导NO 介导的舒张反应具有更高的敏感性［45］，涉及的机制主要是RCN2 以内皮型 NO 合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）为靶点，通过抑制其活性减少 NO 的产生，从而调节血压。eNOS 的活性取决于细胞内Ca2+浓度，是血管张力和血压的关键调节因子［46］。RCN2对高血压的发生具体作用机制尚未明确，其在高血压模型中的影响将成为未来研究的重点。

随着研究的深入，发现动脉钙化不仅是生理现象，而是一种受多种生理病理因素影响的活性调控过程［47］。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）通过增加其迁移增殖的能力、分泌更多基质及增强成骨分化和相关钙化来促进动脉粥样硬化病变的发展［48］。该过程中分化的VSMCs 去分化后，发生成骨转变，最终导致血管钙化［49］。钙磷代谢紊乱也是血管钙化的原因之一［50］，RCN2 在糖尿病患者股动脉斑块中的表达明显高于非糖尿病患者，同时高糖处理人主动脉血管平滑肌细胞（Human aortic vascular smooth muscle cells，HAVSMCs）后，RCN2 表达水平增加，且与钙化程度呈正相关，表明RCN2 可能通过调节成骨分化相关的基因使HAVSMCs 进一步钙化［51-52］。

动脉粥样硬化可造成动脉狭窄或闭塞，从而导致其供应的组织或器官将发生缺血或坏死。动脉粥样硬化为多因素疾病，常见的危险因素有高脂饮食、肥胖、运动减少、吸烟、长期劳累等［53］，遗传因素在该病的发生发展过程中的作用不可忽视［54］。Ath29基因是影响小鼠早期和晚期动脉粥样硬化病变形成的主要易感基因位点，而RCN2 基因是其一种重要的调节基因。敲低RCN2 表达后，内皮细胞氧化磷脂诱导表达的血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）显著降低，通过调节细胞内Ca2+浓度来影响MCP-1 和VCAM-1的表达［55］。VCAM-1 和 MCP-1 是动脉粥样硬化发病机制中的关键，病变程度与VCAM-1 和MCP-1 表达量呈正相关［56］。RCN2 在心血管疾病中的作用是多途径多角度的，其涉及的具体调控机制尚未明确，随着研究的深入，其阻断剂有望在心血管疾病治疗中发挥作用。

4 RCN2 在骨质疏松与肌少症中的作用

骨质疏松是一种全球性具有高发病率的代谢性骨病，其特点包括骨量减少，骨组织微结构恶化及骨脆性增加［57］，其发生原因是由于骨形成和骨吸收之间的不平衡所致［58］。骨质疏松通常分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松，原发性骨质疏松又包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。老年性骨质疏松是由于成骨细胞代谢活性衰退，骨形成减弱，而破骨细胞活跃使骨吸收增强，骨重建失衡所导致的。另外，由于年龄增加，骨髓基质细胞更多分化为脂肪细胞，而非成骨细胞，使骨形成减少，导致骨质疏松的发生［59］。肌少症由 ROSENBERG［60］首次提出，指随年龄增长，肌肉质量和力量降低的表现。2010 年，欧洲老年人肌少症工作组（European Working Group on Sarcopenia in Older People，EWGSOP）根据肌少症的致病原因将其分类为原发性和继发性肌少症［61］。原发性肌少症是与年龄相关的疾病，受多种复杂机制及风险因素影响，主要发病机制是年龄增加引起的神经肌肉功能减退、激素水平降低、炎症因子增加、肌细胞易凋亡、合成代谢率降低等。有研究表明，50岁后肌肉含量每年减少1% ～2%，肌力减少1. 5% ～3%，而80 岁时肌肉含量减少约占总量的30%，肌肉强度与力量下降更明显［62-63］。成肌细胞和成骨细胞均起源于中胚层，肌肉与骨骼位置毗邻，功能相辅，具有相似的分子信号通路，因此可能受到相同遗传因素的调控。研究表明，骨质疏松和肌少症的同时发生可能与 MSTN、α-actinin 3、PGC-1α、MEF-2C、GLYAT和METTL21C 等基因相关［64］。研究表明，维生素D能从骨骼中回收钙并促进骨基质矿化维持骨骼健康，增强肌肉力量和平衡能力，骨质疏松和肌少症的发生与老年人群缺乏维生素D 相关［65-67］。数据库搜索显示，小鼠体内VAF1 与RCN2 的氨基酸同源性达91. 8%。通过酵母双杂交系统利用维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）探针（GST-PD）检测，证实 VDR 与 VAF1 之间存在特异性相互作用［7］，表明RCN2 可能是VDR 特异性的辅助因子，并调节其功能，还能通过维持细胞内Ca2+稳态，进而维持VDR的生物活性。在HAVSMCs 中，RCN2 可上调Runx2和 Osterix 的表达［51］，Runx2 和 Osterix 是成骨细胞发育相关的转录因子，因此RCN2 可能通过参与调控细胞生长发育及凋亡而影响老年性骨质疏松和肌少症的发生。另外，RCN2 可能直接调节成骨分化相关基因参与骨代谢或通过与VDR 相互作用来影响肌肉、骨骼的生理活动。目前，国内外尚未见RCN2在骨质疏松或肌少症等疾病中的研究，其作用机制及应用潜力尚需进一步深入探索。

5 小结与展望

目前，人们对RCN2 的关注及相关研究均较少，尤其是在骨骼肌肉相关疾病中。RCN2 在哺乳动物细胞中普遍存在，是细胞进行生理活动必不可少的分泌蛋白，不仅自身参与信号通路的调控，还能通过结合相关蛋白形成复合物进而发挥其功能，在疾病的发生发展中扮演重要角色。综上所述，虽仍有许多RCN2 的生理和病理生理机制尚未明确，但多项研究证明，RCN2 是一种具有研究潜力，且开发前景广阔的蛋白，随着研究的不断深入，有望成为肿瘤、心血管疾病及老年性骨质疏松和肌少症等疾病的生物标志物及治疗干预靶点。