2019—2020 年辽宁省沿海城市甲型肝炎病毒基因特征分析

任丽萍，邵玉平，王艳，孙静，杨晓丽，刘杨，赵玲，韩一楠，于艳，方兴

1. 辽宁省疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110005；2. 丹东市疾病预防控制中心，辽宁 丹东 118000；3. 大连市疾病预防控制中心，辽宁 大连 116000；4. 盘锦市疾病预防控制中心，辽宁 盘锦 124000

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）感染引起的一种以肝脏炎症病变为主的传染病［1］。HAV 是小 RNA 病毒科肝病毒属（Hepatoviruses）的唯一成员，单正链RAN，基因组全长约为7 500 bp［1］，包括5′和3′端非翻译区和1 个编码2 227 个氨基酸残基多聚蛋白的开放阅读框，多聚蛋白经蛋白酶水解可裂解为 P1、P2 和 P3，P1 进一步裂解为 VP4、VP3、VP2、VP1，P2 和 P3 分别包括 2A ~ 2C 和 3A~3D 非结构蛋白［2］。根据 VP1 ／ 2A 连接处基因序列，HAV可分为来源于人的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型（又可分为A、B 两种亚型）和来源于猿的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型［3］。HAV 在环境中较为稳定，以粪-口途径为主要传播途径［3］。甲型肝炎在印度、泰国等发展中国家或地区较为流行，在发达国家或地区的流行呈下降趋势［4］。本文对2019 —2020 年辽宁省沿海城市HAV 基因特征进行分析，以期为辽宁省甲型肝炎的防控提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 标本 2019 年丹东市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者粪便标本11 份，盘锦市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者粪便标本6 份；2020 年丹东市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者血清标本123 份，大连市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者血清标本22 份。共162 份标本，均于-20 ℃保存，4 ℃条件下运输。

1. 2 主要试剂及仪器 One Step RT-PCR Kit、QIAGEN RNeasy Mini Kit 及 QIAquick Gel Extraction Kit 均购自德国QIAGEN 公司；Big Dye Terminator V 3.0 Cycle Sequecing Ready Reaction Kit 及 ABI3100 测序仪均购自美国ABI 公司。

1. 3 HAV 核酸的提取及扩增 用QIAGEN RNeasy Mini Kit 试剂盒提取病毒核酸，以其为模板，通过QIAGEN OneStep RT-PCR Kit 对 HAV VP1 ／2A 序列进行巢式PCR 扩增。第1 轮扩增特异性引物为HAV-1F：5′-GACAGATTCTACATTTGGATTGGT-3′，HAV1R：5′-CCATTTCAAGAGTCCACACACT-3′，扩增产物大小为512 bp；以第1 轮PCR 产物为模板进行第2 轮PCR扩增，第2轮扩增特异性引物为HAV2F：5′-CTATTCAGATTGCAAATTACAAT-3′，HAV2R：5′-AACTTCATTATTTCATGCTCCT-3′，扩增产物大小为392 bp。PCR反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火25 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环；72 ℃再延伸10 min。

1. 4 序列测定及结果分析 PCR 扩增产物经QIAquick Gel Extraction Kit 胶纯化试剂盒纯化后，采用ABI3100测序仪进行序列测定。通过GenBank（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）对序列进行在线比对分析，鉴定基因型。

1. 5 亲缘关系进化树的构建 应用Mega 6. 0 软件对获得PCR 阳性样本的HAV 基因序列进行分析，通过Neighbor-Joining 方法构建亲缘关系进化树，分析基因序列同源性。选取28 个代表序列，并从GenBank 中下载全球HAV 不同型别的基因序列，通过Neighbor-Joining 方法构建亲缘关系进化树，进行核苷酸同源性分析。

2 结 果

2. 1 标本的鉴定 2019 年丹东市的11 份甲型肝炎粪便标本均呈PCR 阳性，阳性率为100%；盘锦市的6 份甲肝粪便标本中，4 份为PCR 阳性，阳性率为66. 67%。2020 年丹东市的123 份血清标本中，90份为PCR 阳性，阳性率为73. 2%；大连市的22 份血清标本均为PCR 阳性，阳性率为100%。

2. 2 序列分析 将测序获得的HAV VP1 ／ 2A 序列通过GenBank 在线比对分析，判定2019 — 2020 年辽宁省沿海城市流行的HAV 为ⅠA 基因型。

2. 3 亲缘关系进化树分析 2019—2020 年辽宁省沿海城市流行的HAV VP1 ／ 2A 区核苷酸序列同源性达97%以上。PCR 扩增呈阳性的127 份样本HAV 基因序列构建亲缘关系进化树，可分为2 个进化分支（分支1 和分支2），见图1。分支1 及分支2 与日本、韩国流行HAV 的核苷酸序列同源性分别达98. 8% ~100%和98. 4% ~ 100%，见图2。表明2019 — 2020年辽宁省沿海城市流行的HAV 与日本、韩国等国家或地区的HAV 同源性较高，属于同一进化分支。

图1 2019 — 2020 年辽宁省沿海城市流行的HAV 亲缘关系进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of HAV epidemic in coastal cities of Liaoning Province from 2019 to 2020

图2 2019 — 2020 年辽宁省沿海城市流行的HAV 与其他国家或地区HAV 的亲缘关系进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of HAV in coastal cities of Liaoning Province and in other countries or regions from 2019 to 2020

3 讨 论

Ⅰ型HAV 广泛流行于美洲、欧洲、亚洲等全球各地［5-9］；Ⅲ型 HAV 主要流行于伊朗、印度、尼泊尔、阿富汗、土耳其、韩国等亚洲国家或地区［10］；Ⅱ型HAV 仅在法国、美国等少数国家或地区有报道［11］，有研究表明，在中非等地区，Ⅱ型HAV 长期流行，法国的Ⅱ型HAV 流行病学调查显示，多数患者均具有非洲旅行史［12］。俄罗斯流行的HAV 以ⅠA 型为主，并伴有ⅢA 基因型［13］；土耳其流行的 HAV 有ⅠA、ⅢA 两种基因型［10］；委内瑞拉等南美国家或地区流行的 HAV 以ⅠA 型为主［14］；韩国则以ⅠA、ⅠB、ⅢA 3 种基因型为主［9］。中国流行的HAV 基因型为Ⅰ型，未见Ⅱ、Ⅲ型相关报道，多数省份流行的基因型为ⅠA 型，河南新乡等少数地区有ⅠB 基因型流行［15-17］。本实验对2019 — 2020 年辽宁省甲型肝炎发病率较高的盘锦、丹东和大连市急性期甲型肝炎患者血清或粪便标本进行了PCR 扩增和测序分析，结果表明，辽宁省沿海地区流行的HAV 均为ⅠA 型，分为 2 个进化分支，其 VP1 ／ 2A 序列与日本、韩国等国家或地区流行的HAV 高度同源，属于同一个大进化分支；与浙江、石家庄等地的HAV 进化距离较远。WANG 等［17］研究也表明，新疆、宁夏、河北、河南等地流行的HAV 与日本、韩国等地区流行的HAV 属于不同的进化分支。

2008 年，甲型肝炎疫苗纳入儿童免疫规划，辽宁省甲型肝炎发病整体下降，2014 — 2016 年出现一次流行，主要发生在丹东、大连地区，冬春季节为高发期，季节分布性明显［18-19］。大连市对2020 年1 —2 月报告的病例流行病学调查表明，80%以上病例有生食或半生食海鲜的习惯［19］；泰国对贝类海产品的一项研究表明，3. 8%的贝类海产品中检测到ⅠA型HAV［20］；意大利西西里地区在贝类研究中发现，13%的贝类海产品中检测到Ⅰ型HAV，并检测到肠道病毒、诺如病毒、腺病毒等病毒［21］。海产品的污染和当地生食海鲜的习惯可能是大连和丹东市HAV 冬春季节高发的重要原因。本研究为辽宁省甲型肝炎的防控提供了实验依据。辽宁省非沿海地区流行HAV 的流行基因型监测，及其与沿海地区间的关联性有待进一步深入研究。