虎奶菇不同栽培方案及其子实体抗氧化研究

付圣麟　方　亮　苏广林　刘　斌

虎奶菇不同栽培方案及其子实体抗氧化研究

付圣麟1,2方亮1,2苏广林1,2刘斌1,2

（1.广西大学食用菌研究所广西南宁530005；2.广西大学农学院应用微生物研究所广西南宁530005）

文章旨在探究不同木屑搭配菌草后对虎奶菇产量及其子实体抗氧化的影响。选取苦楝木屑、松木屑和杉木屑3种木屑，共设置3种不同栽培配方：A.苦楝木屑52%、菌草26%、麸皮20%、石灰1%、石膏1%；B.松木屑52%、菌草26%、麸皮20%、石灰1%、石膏1%；C.杉木屑52%、菌草26%、麸皮20%、石灰1%、石膏1%。测定不同配方下的菌包产量、子实体活性物质含量及抗氧化活性。试验结果表明：配方B的子实体产量最高，达到160.13 g/包；配方B栽培的子实体的多糖、三萜和多酚含量均最高，分别为21.84 mg/g、14.76 mg/g、4.37 mg/g；配方B栽培的子实体的醇提物对DPPH的清除能力最强，7 mg/mL醇提物的清除率可达81.50%；配方A栽培的子实体的醇提物对ABTS的清除能力最强，1.0 mg/mL醇提物的清除率可达87.69%。

虎奶菇；木屑；栽培；产量；抗氧化

虎奶菇[(Fr.) Sing]，别名菌核侧耳、茯苓侧耳、虎乳菌，为木腐生真菌，属担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，具有重要的药用价值，其耐高温，主要种植在热带和亚热带地区，一般能在木桩或者土壤内的腐木上生长[1]。该菌也是一种子实体和菌核都能食用的珍稀食药用菌[2]。

食用菌具有非常高的营养价值和药用保健的药理功效，食用菌多糖在抗癌方面具有一定的优越功效[3]。此外，还能降低某些物质诱发肿瘤的发生率，并对多种化疗药物具有增效效应[4]。

目前侧耳类食用菌栽培多使用棉籽壳培养基，而贵州省农作物品质资源研究所开发的松杉木锯末发酵熟料竹荪脱袋培养基解决了农业废料的污染问题。研究发现，利用锯末的培养基产量与效率较低，且开发难度大[5]，尤其针对针叶木材废料在食用菌栽培培养基的开发较少[6]。其树脂道中分泌树脂酸等是针叶树防御虫害及其共生微生物入侵的重要途径[7]，所以目前利用木屑的培养基中几乎都是阔叶木材[8]。针叶木屑作为许多木材加工厂的副产物，是一种可以利用起来的潜在资源[9]。

本研究以不同针叶木屑为主料设置栽培配方，对其产量和活性物质进行了初步研究，筛选出适宜的木屑栽培虎奶菇，以期为木屑的有效利用和虎奶菇的栽培提供参考方向。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与材料

试验所用菌株采自广西壮族自治区来宾市经分子鉴定与形态鉴定确定种属，现保存于广西大学微生物研究所。

木屑来源于南宁市木材加工市场，麸皮等发酵粗料均来自广西大学微生物研究所菌种厂；试剂包括硫酸钙等常用试剂，均购于成都科龙化工有限公司；仪器有SYW-2食用菌自动装袋机（随州智宸机械有限公司）、KQ-300GDV恒温数控超声波清洗器（昆山舒美仪器有限公司）等。

1.2 菌种培养基

母种培养基为PDA，即200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂、1 g磷酸二氢钾、0.5 g硫酸镁，加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.3 栽培方案设计

不同栽培方案设计如表1。

表1虎奶菇栽培料配方表

配方编号苦楝木屑/%松木屑/%杉木屑/%菌草/%麸皮/%生石灰/%石膏/% ABC52———52———52262626202020111111

1.4 栽培管理

按照上述表1配方，将配料拌匀，控制含水量为60%，搅拌均匀后装入15 cm×33 cm的聚丙烯袋，每袋装料重量为500 g（湿重），用棉花塞紧封口，贴好标签，放入高压灭菌锅121 ℃灭菌2 h。每个配方设置10个重复。

将接种好的菌袋放入栽培菇房进行菌丝培养，培养期间温度设置为25 ℃～28 ℃，湿度保持在70%～80%。

待菌丝长满菌袋后，即可开袋放入出菇菇房进行出菇，出菇期间保持菇房温度为28 ℃，湿度为80%，每天间断日光灯光照3 h～6 h。

1.5 多糖类化合物含量测定

1.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取干燥至恒重的葡萄糖1.00 g，加水溶解定容到100 mL，即标准溶液浓度为10.0 mg/mL。对标准溶液进行稀释，得到浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的葡萄糖溶液各2.0 mL。以蒸馏水为对照，各试管加入5%苯酚溶液0.50 mL摇匀。再分别加入2.50 mL浓硫酸，充分摇匀后，室温下静置15 min，于490 nm波长处测得其相应吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出葡萄糖浓度与吸光度值之间关系的标准曲线，得到回归线方程和线性范围。

1.5.2 虎奶菇子实体多糖类化合物含量测定

将采摘后的虎奶菇子实体放入烘箱烘干至恒重后粉碎，称量1 g子实体粉末，置于25 mL试管中，加入80%乙醇25 mL，混合均匀后，置于超声破壁仪中超声30 min，用苯酚-硫酸法测定多糖含量，测定具体操作方法同1.5.1。

1.6 三萜含量测定

1.6.1 三萜标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至恒重的齐墩果酸（对照品）10.0 mg，以色谱级甲醇配制成0.2 mg/mL的溶液。分别精密吸取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL该溶液置于刻度试管中，60 ℃水浴蒸发干溶剂，加入新配制的0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及1.2 mL高氯酸，70 ℃恒温水浴15 min后冰水浴冷却。再加入乙酸乙酯使体系总量为4 mL，摇匀，于550 nm波长处测定吸光度，以对照品溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.2 虎奶菇子实体三萜含量测定

称量1 g虎奶菇子实体粉末于锥形瓶中，加入25 mL乙醇，连续超声45 min，过滤后将滤液置于100 mL容量瓶中定容待测。参照NY/T 1676—2008，用香草醛-冰醋酸法测定醇提物中的三萜含量[10]。吸取待测样品溶液1.0 mL置于试管中60 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸1.2 mL后，按齐墩果酸对照品溶液处理方法处理，于550 nm波长下测定吸光度，计算样品中三萜类化合物含量。

1.7 多酚含量测定

称取虎奶菇子实体粉末0.25 g，加8 mL水超声60 min，加水定容至10 mL。取2 mL于离心管中，12 000 r/min离心10 min，上清液转至新离心管中，即虎奶菇供试样液。具体测定多酚含量操作参照李洋洋等（2017）[10]的方法。

1.8 抗氧化活性测定

1.8.1 清除DPPH自由基能力测定

将上述1.6中醇提物样品稀释成不同浓度，样品组为2 mL不同浓度样品+2 mLDPPH试剂，对照组用无水乙醇代替DPPH，空白组用无水乙醇代替样品。测定方法参考范三红等（2020）[11]的方法并加以改动。

1.8.2 清除ABTS自由基能力测定

参照谢惠等（2017）[12]的方法并加以改动。样品组为2 mL不同浓度样品+2 mLABTS试剂，对照组用蒸馏水代替ABTS，空白组用蒸馏水代替样品。

1.9 数据处理

采用Origin2018软件绘图，并采用Excel和SPSS 25软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 出菇产量

待子实体生长至八分成熟后采收，将每袋子实体采收后用天平称量子实体鲜重，计算出不同配方的平均产量，结果如表2。

表2不同配方出菇产量及显著性差异分析比较

配方编号单包产量/（g/包）显著性差异（P＜0.05） ABC135.08±3.99160.13±4.6693.10±2.63 bac

由表2可知，供试的不同木屑配方中，配方B的产量和配方A、C的产量均存在显著性差异。其中，配方B的产量在3种配方中是最高的，其单包产量达160.13 g；而以杉木屑为主料的配方C产量最低，仅为93.1 g/包，与B相比，其单包产量相差41.98 g。

2.2 不同配方下虎奶菇子实体活性成分含量比较分析

（1）活性成分标准曲线绘制。

图1　苯酚-硫酸法葡萄糖含量标准曲线

图2　香草醛-冰醋酸法三萜含量标准曲线

根据实验结果，得到如图1苯酚-硫酸法葡萄糖标准回归曲线=0.067 5－0.066 3，²=0.999，以及图2香草醛-冰醋酸法三萜含量标准回归曲线=2.561 1－0.026 5，2=0.999，以此作为后续测定值的计算依据。

（2）子实体活性成分含量比较分析。

图3　不同配方虎奶菇子实体活性成分含量

由图3可知，3种不同木屑对虎奶菇子实体内的多糖、三萜以及多酚等活性成分含量均有一定的影响。其中，在多糖含量方面，配方B的子实体多糖含量最高，为21.84 mg/g，配方C的多糖含量最低，其含量与配方B相差1.09 mg/g。

三萜含量方面，以松木屑为主料的配方B栽培的虎奶菇子实体内三萜含量最高，达到14.76 mg/g，其次是以苦楝木屑为主料的配方A，而以杉木屑为主料的配方C栽培的子实体三萜含量最低，为12.77 mg/g，与配方B相差1.99 mg/g。

在多酚含量方面，也是以松木屑为主的配方B栽培的子实体含量最高，为4.37 mg/g，其次为配方C，配方A的含量最低，为3.9 mg/g。因此，综合分析，配方B栽培的虎奶菇子实体的多糖、三萜、多酚这些活性物质含量均为最高。

2.3 不同配方虎奶菇子实体醇提物的抗氧化活性分析

图4　不同配方下虎奶菇子实体醇提物对DPPH的清除率

图5　不同配方下虎奶菇子实体醇提物对ABTS的清除率

如图4，随着浓度的增大，不同木屑栽培的子实体醇提物对DPPH自由基的清除率都呈稳定上升趋势。当醇提物浓度为1 mg/mL～5 mg/mL时，3种配方下的子实体醇提物对DPPH自由基的清除率均呈快速上升趋势，且配方A的子实体醇提物对DPPH的清除率较高于配方B、C；当醇提物浓度大于5 mg/mL时，清除率的上升趋势逐渐缓慢趋平，但配方B的子实体醇提物对DPPH的清除率相较于配方A和C增长迅速；当醇提物浓度达到7 mg/mL时，不同配方下的子实体醇提物的DPPH自由基清除率均达到最大值，分别为80.78%（A）、81.50%（B）、77.64%（C），即B＞A＞C。

如图5，随着浓度的增大，不同木屑栽培的子实体醇提物对ABTS自由基的清除率也呈上升趋势[10]。当醇提物浓度为0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时，配方A的子实体醇提物对ABTS的清除率均高于配方B、C；当醇提物浓度为0.6 mg/mL～1.0 mg/mL时，配方C的子实体醇提物的清除率高于配方B；当醇提物浓度达到1.0 mg/mL时，配方A的子实体醇提物的ABTS清除率最高，为87.69%，此时配方C的子实体醇提物的清除率接近配方A，为84.00%，而配方B为78.53%，即A＞C＞B。

3 讨论

通过使用不同木屑对虎奶菇进行栽培，对比其产量和活性物质含量，发现苦楝木屑、松木屑和杉木屑中，松木屑对虎奶菇栽培产量提高效果显著。之后对虎奶菇活性物质进行测定分析，发现松木屑栽培的虎奶菇子实体中多糖、三萜及多酚这些活性物质含量也是最高的。因此，从这3种木屑中可筛选出松木屑和菌草搭配更适宜栽培虎奶菇，希望本实验能为木屑资源的有效利用提供参考。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2021.12.07

S646

A

2095-1205(2021)12-18-03

刘斌