气相色谱-串联质谱法测定医用橡胶弹性体中的12种N-亚硝胺残留量

刘爱娟， 刘雪婷， 薄晓文， 孟 凯， 亓晓庆， 沈 永*

(1.山东省医疗器械产品质量检验中心,山东济南 2501012.山东省医疗器械生物学评价重点实验室,山东济南 2501013.国家药品监督管理局药品包装材料质量控制重点实验室,山东济南 250101)

N-亚硝胺是具有-N-N=O官能团的—类物质的总称，属于强致癌有机化合物。橡胶制品中的N-亚硝胺主要产生于橡胶的高温硫化成型过程。在特定的使用环境下，橡胶制品中残留的N-亚硝胺可能被释放出来，进而通过呼吸道、消化道、皮肤吸收或血液循环等方式进入人体，对人体造成巨大危害[1]。我国国家药品监督管理局药品审评中心2018年发布的《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则(试行)》中，明确要求密封件中应关注亚硝胺及类似结构化合物的检出。亚硝胺、亚硝基类物质在现有分析技术条件下应不得检出(欧盟指令为亚硝胺浸出不得过0.01 mg/kg弹性体，亚硝基类物质浸出不得过0.1 mg/kg弹性体)。由于现有国家标准(GB/T 24153-2009)《橡胶及弹性体材料N-亚硝基胺的测定》中的方法的测定下限为0.5 mg/kg，不能满足安全性评价的需求，因此需建立更加灵敏的分析方法。

近年来，国内外对亚硝胺残留测定的研究较多，但多集中在食品[2 - 6]、水[7,8]和各种日用橡胶制品，如橡胶密封材料[9,10]、婴儿奶嘴[11,12]、橡胶玩具[13 - 15]，橡胶手套[16,17]及避孕套[18,19]，在药剂中也有涉及[20]，而对医用橡胶材料中残留的亚硝胺类物质评价工作开展较少[21]。由于各种不同种类的橡胶制品在药品包装材料及医疗器械中均有相当数量的使用，如橡胶塞、注射器活塞及植入类硅橡胶器械等，其临床使用的特点及与人体接触方式的特殊性也要求更合理的设计样品浸提条件，从而科学评估该类产品的安全风险。本研究针对医疗器械及药品包装材料中使用的橡胶弹性体，采用极限浸提法对样品中的亚硝胺类物质进行浸提，并利用气相色谱-串联质谱仪的选择反应监测(SRM)模式，对49批次医用橡胶弹性体中的亚硝胺类物质进行准确定量，为医用橡胶材料中残留的亚硝胺类物质的评价提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ-8000 Evo气相色谱-串联质谱仪(美国，Thermo Fisher公司)；超声波恒温清洗机(宁波新芝)；Vortex-2涡旋振荡器(美国，Scientific Industries)；高速离心机(德国，Sigma公司)；Cleanert Nitro亚硝胺专用净化管(艾吉尔公司)。

12种亚硝胺标准品(表1)：o2si，批号：353499，纯度100 mg/L；内标N-亚硝基二异丙胺(NDiPA)标准品，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号：157733ME，纯度100 mg/L；丙酮：色谱纯，Fisher。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准储备溶液的配制精密吸取12种亚硝胺标准品适量于容量瓶中，加入丙酮稀释至1 mg/L，得到亚硝胺标准储备溶液，于-20 ℃下避光保存。

1.2.2 内标储备溶液的配制精密吸取NDiPA标准品适量于容量瓶中，加入丙酮稀释至10 mg/L，得到NDiPA内标储备溶液，于4 ℃下避光保存。精密移取NDiPA内标储备溶液适量，加入丙酮稀释至20 ng/mL，得到NDiPA内标工作溶液，于4 ℃下避光保存。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：HP-FFAP色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：270 ℃；柱升温程序：40 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率升温至140 ℃，保持5 min，以50 ℃/min的速率升温至240 ℃，保持10 min(共计31.5 min)；载气：高纯氦；柱流速：1.5 mL/min。不分流进样，进样量1 μL。

质谱条件：电子轰击(EI)电离源，电离能量70 eV；离子源温度300 ℃，溶剂延迟：3.5 min；扫描模式：选择反应监测(SRM)模式。质谱参数见表1。

表1 13种亚硝胺SRM条件

1.4 样品前处理

对胶塞、活塞、护帽、硅橡胶产品，将其剪碎成3 mm×3 mm左右的小颗粒，按照2 mL/g的比例加入内标溶液，将容器密封并充分混匀，置于40 ℃水浴中超声浸提1 h，放至室温后，取浸提液于亚硝胺专用净化柱中，涡旋混匀后离心，取上清液进样分析测试。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的建立

2.1.1 色谱柱筛选采用12种亚硝胺标准品进行色谱柱筛选。本研究主要对DB-WAX柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)和HP-FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)两种色谱柱进行考察。结果表明，HP-FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)能够较好地实现12种亚硝胺的分离，且峰形良好，基线背景较低，出峰时间最短，故选择该色谱柱进行亚硝胺分离。

2.1.2 色谱条件优化通过优化色谱分离条件，实现对12种亚硝胺的有效分离，缩短总体运行时间，并增加内标1种。优化后的色谱图见图1。

图1 13种亚硝胺总离子流(TIC)色谱图

2.1.3 质谱条件优化对13种亚硝胺进行质谱全扫描，选取特征离子作为母离子，通过二级质谱选择相应的子离子对，采用仪器自动优化SRM离子对的方式进行碰撞能量优化，最终确定了定量和定性离子对以及最优碰撞能量。优化后的质谱参数见表1，定量质谱图见图2。

图2 13种亚硝胺MRM色谱图

2.2 样品极限浸提条件优化

2.2.1 浸提溶剂选择考虑到不同种类亚硝胺的溶解性，首先进行浸提溶剂的筛选。选择甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷、水5种不同极性的溶剂，分别对厂家A的样品(已知含有NDPHA和NDBzA)进行浸提，将样品活塞剪碎成3 mm×3 mm小颗粒，称取1 g并加入5 mL溶剂，于25 ℃超声1 h，浸提液经0.45 μm的滤膜过滤后进样分析。对比后发现，丙酮对样品中NDPHA、NDBzA提取效果最好。

此外，为考察溶剂效应，分别使用甲醇、丙酮配制不同浓度标准溶液进样测试，12种亚硝胺峰面积相近，故可判定甲醇及丙酮对12种亚硝胺溶解及测试无影响。同时，由于甲醇作为溶剂时可能对某些化合物有溶剂效应，因此本研究选用丙酮作为浸提溶剂。

2.2.2 浸提温度选择考虑到橡胶弹性体在使用时可能会接触人体，也可能在较高的室温下使用，故比较了25 ℃与40 ℃的浸提能力。选用厂家A的样品，分别在25 ℃和40 ℃超声0.5 h浸提，取浸提液过滤后测试。结果表明，40 ℃时的浸提效果优于25 ℃。同时对标准溶液的超声稳定性进行试验，配制一定浓度的亚硝胺标准混合溶液，分别在25 ℃和40 ℃超声0.5 h后进样测试，结果表明两种温度下超声对标准溶液峰面积无明显影响。综合样品及标准溶液的测试结果，选择40 ℃为浸提温度。

2.2.3 极限浸提条件按照2 mL/g的比例加入丙酮，在40 ℃超声下分别浸提0.5、1.0、1.5 h后，将浸提液过滤后进样测试，按时间段计算目标物的浸提量，以浸提出测得的累积残留量无明显增加的时间作为极限浸提。结果表明，样品在超声1 h后，浸提得到的量无明显增加，故选择1 h作为极限浸提时间。

2.3 样品前处理方式优化

本研究对C18小柱、亚硝胺专用柱及直接过滤进样几种前处理方式进行了比较。传统的C18小柱需进行柱活化、上样、淋洗、浓缩等过程，操作比较复杂，而且浓缩过程会导致亚硝胺的挥发而使回收率偏低；直接过滤进样会使得萃取液中大量的抗氧剂、添加剂等杂质直接进入色谱柱，带来系统污染。而使用亚硝胺净化专用柱只需取浸提液涡旋混匀后离心，即可取上清液进样测试，该方法操作简单，可不经过浓缩直接进样，并能有效减少浸提液中杂质的干扰，减少了样品损失。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性对空白溶液及样品溶液分别进样分析，得到色谱图3、图4(标准溶液色谱图见图2)。由图可知，13种亚硝胺可得到完全分离，且空白溶液及样品基质对化合物出峰无干扰。

图3 空白溶剂色谱图(丙酮)

图4 样品溶液色谱图

2.4.2 检出限与定量限配制不同浓度亚硝胺标准溶液，进样测试，以信噪比(S/N)=3时的浓度作为该化合物的检出限；配制不同浓度亚硝胺标准溶液，加入空白橡胶样品(不含亚硝胺)中，经过极限浸提后过净化柱，进样测试，以S/N≥10时的浓度作为该物质的定量限，结果见表2。

表2 12种亚硝胺的检出限(LODs)及定量限(LOQs)

2.4.3 线性范围以内标溶液作为溶剂，配制浓度为0.6～200 ng/mL的12种亚硝胺混合标准溶液，优化条件下进样分析。各化合物的线性范围见表3。

表3 12种亚硝胺的线性方程及线性范围

2.4.4 精密度与准确度选取低、中、高3个浓度的标准溶液，连续进样6次，进行精密度测试，结果见表4。选取空白卤化丁基胶塞样品(无亚硝胺)，剪成3 mm×3 mm颗粒，按照2 mL/g的比例加入内标溶液，并分别加入一定浓度的标准溶液，超声提取，进行回收率试验。每个化合物选取低、中、高3个浓度，每个浓度平行3次。回收率结果见表4。

表4 12种亚硝胺精密度及回收率

(续表4)

2.5 样品测试

选取卤化丁基橡胶塞产品25批次(来源12个生产厂家，其中进口2家，国产10家)，卤化丁基橡胶活塞18批次，聚异戊二烯橡胶护帽1批次，硅橡胶医疗器械5批次进行分析测试。25批次卤化丁基橡胶塞中有14批次有检出，检出NDEA、NDBA、NEPHA、NPIP、NPYR、NMOR及NDBzA 7种亚硝胺。18批次卤化丁基橡胶活塞均检出亚硝胺物质，共检出NDMA、NDEA、NDBA、NEPHA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPHA及NDBzA 9种亚硝胺。1批次聚异戊二烯橡胶护帽中检出NDBzA，5批次硅橡胶医疗器械中有3批次检出亚硝胺物质，共检出NDEA及NDBzA 2种亚硝胺。通过49批次样品中检出的N-亚硝胺的种类及含量情况可以看出，12种N-亚硝胺类物质除NEMA、NDPA、NMPHA外，其余9种均有检出，且NEPHA、NDPHA及NDBzA最高含量均已超过200 ng/g。

从以上试验发现，卤化丁基橡胶活塞中检出的亚硝胺物质种类最多，共9种，卤化丁基橡胶塞中检出了7种亚硝胺物质，医用硅橡胶中亚硝胺检出的种类最少，且含量较低。

胶塞和活塞样品属于药品包装材料中最为常用的橡胶弹性体，实验结果显示，活塞中检出的亚硝胺种类及数量均高于胶塞。就材质来讲，胶塞和活塞均属于卤化丁基橡胶，而活塞中检出的亚硝胺种类及含量均高于胶塞，可能是由于活塞的生产过程中加入了炭黑，而炭黑的表面积较大，容易吸附氮氧化物，在一定程度上促进了N-亚硝胺的形成[1]，故残留量较多。

3 结论

本研究针对医用橡胶弹性体及硅橡胶等药品包装材料和医疗器械，采用气相色谱-串联质谱仪的选择反应监测(SRM)模式，对胶塞、活塞、护帽及硅橡胶医疗器械等产品中的亚硝胺类物质进行检测。建立的方法可对12种亚硝胺及1种亚硝胺内标实现良好分离，线性范围宽，灵敏度高。对49批次样品定量分析发现，目前医用橡胶弹性体中仍然有不同程度的亚硝胺残留。由于检测的产品种类多数量大，具有一定的统计学意义，有助于生产企业和监管部门对目前市场上医用橡胶弹性体中亚硝胺残留的风险评定提供技术依据。