基于苹果多酚的NFC苹果汁鉴伪方法的建立

刘 靓，雷佳蕾，梁佳蕊，邓 红，2，3，孟永宏，2，3，郭玉蓉，2，3

（1.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；2.国家苹果加工技术研发专业中心，陕西西安710119；3.西部果品资源高值利用教育部工程研究中心，陕西西安710119）

0 引言

中国是苹果栽培大国，种植面积与产量均居世界第一，2019仅陕西省苹果产量达到1 135.58万t，种植面积62万hm2。除用作鲜食外，大量的外形欠佳、品质良好苹果被加工为果汁[1-2]。而全球每年消耗超过1 600万t的果汁中苹果汁占有重要的市场份额。近年来，随着消费者的健康意识不断提高，NFC（Not form concentrate，非浓缩还原汁）苹果汁的销量日益增高。正是NFC果汁高昂的售价和广阔的市场背景，使它成为掺假的目标[3-4]。因此，NFC果汁的真实性一直是政府机构与消费者关注的问题；为了确保公平的市场竞争和消费者利益并促进国际贸易，急需开发能够检测NFC果汁真实性的技术，并在生产实践与产品销售中加以利用。

NFC（Not form concentrate，非浓缩汁）果汁产品掺假主要是用FC（Form concentrate，浓缩汁）加水复原代替NFC苹果汁或是在NFC苹果汁中掺入部分FC果汁进行销售，但FC与NFC果汁的化学成分差异不大，传统的物理和化学分析方法难易区分FC与NFC，目前主要是利用稳定同位素技术[5-6]进行鉴伪；这种方法已经获得了美国分析化学师协会（AOAC）及欧盟标准化委员会（ComitéEuropéen de Normalisation，法文缩写：CEN）的认可（如标准ENV 12141和ENV 12142）。雷佳蕾等人[7]利用IRMS（Isotope ratio mass spectrometry，同位素比率质谱法）分析测定了16个不同品种的苹果NFC与FC果汁的δD、δ18O值，得出相似的结果；但IRMS[8-9]的定量分析还不尽人意。

陕西苹果产量居中国第一，苹果是带动陕西经济发展的重要支柱产业。苹果中的多酚种类、含量与苹果品种、原产地、种植条件、成熟期、生态环境等因素密切相关，中外学者对苹果多酚的研究非常多且方法比较成熟[10-13]，尤其是不同品种的苹果，所含有的苹果多酚类物质的种类及含量都不相同，不同品种苹果间多酚的差异也是抗氧化能力不同的根本原因。

目前，对不同品种苹果多酚的研究尚不多见，冉军舰等人[14]在13种苹果中均检测出10种单体酚，鞣花酸、绿原酸、表儿茶素的含量相对较高，儿茶素、咖啡酸、原儿茶酸的含量相对较低。李鑫[15]以35个品种苹果（Malus pumila Mill.）果实为材料，研究总酚、总原花青素等指标，证实不同品种间总酚含量差异显著。Urska Vrhovsek等人[16]研究了意大利、委内瑞拉等西方国家的41个苹果品种中的多酚物质，发现不同品种苹果总多酚的平均含量在66.2～211.9 mg/100 g，主要类别是黄烷醇，其次是羟基肉桂酸、黄酮醇、二氢查耳酮和红苹果花青素。

探讨不同品种苹果汁NFC与FC中多酚种类含量差异的研究尚是空白，试验通过提取和分析研究不同品种苹果的NFC与FC果汁中的多酚类物质的种类和含量的差异，用于苹果（NFC）果汁的真伪的鉴别，试验结果为苹果（NFC）果汁的质量监控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

苹果原料品种10个（自由、延光、橘苹、富士、寒福、黛绿、嘎啦、首红、乔纳金、元帅）采于西北农林科技大学白水苹果试验站，并于4℃下冷藏保存；多酚标准品（没食子酸，绿原酸，咖啡酸，4-羟基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素、根皮素11种标准品），Sigma公司提供；试剂（无水乙醇、异丙醇、氯仿、琼脂糖、乙酸乙酯、冰醋酸等均为分析纯试剂，甲醇为色谱纯试剂），西安市森博玻璃仪器采供站提供。

1260 Infinity型安捷伦高效液相色谱仪，上海安捷伦科技公司产品；C18型液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），上海安捷伦科技公司产品。

1.2 试验分析方法

1.2.1 NFC、FC、AAJ苹果汁的制备

NFC、FC苹果汁的制备参照文献[2]方法进行，掺假果汁（Adulterated apple juice，AAJ）苹果汁的制备参见文献[9]。

1.2.2 不同品种NFC、FC苹果汁中多酚的分析

（1）单体酚标准溶液的制备。参照文献[11]分别称取0.1 mg没食子酸、绿原酸、咖啡酸、4-羟基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素、根皮素、根皮苷等标准品，分别溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中混匀，放置于冰箱中，于4℃下避光保存备用，待色谱分析。根据单体酚标准品的保留时间判断混合标准品HPLC色谱图中各个峰所代表的多酚物质。

（2）混合标品标准溶液的制备。参照文献[11，17]分别称取没食子酸0.1 mg、绿原酸0.6 mg、咖啡酸0.6 mg、4-羟基苯甲酸0.2 mg、儿茶素0.6 mg、表儿茶素0.6 mg、芦丁0.8 mg、槲皮苷0.5 mg、根皮素0.5 mg、根皮苷0.5 mg、槲皮素标准品0.5 mg，溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中混匀。分别从以上每个单体酚标准溶液中取出1 mL混合均匀，于4℃下避光保存备用，待色谱分析；用于制作混合标准品HPLC色谱图。

（3）苹果多酚的HPLC法测定色谱条件的确定。参照文献[17]，选择色谱柱为Welchrom C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，紫外检测波长为280 nm，进样量20 μL；流速1 mL/min，柱温30℃；流动相A相0.3%的冰乙酸，流动相B相100%的甲醇（色谱纯）。

（4）梯度洗脱程序参照文献[18]确定。以100%的甲醇和0.3%的冰醋酸为流动相通过调整梯度洗脱程序及单体酚标准品的质量浓度以达到分离混合标准品中多酚物质的目的，使混合标准品中的各个单体酚标准品的保留时间相差较大，高效液相参照1.2.2（2）的方法制作标准曲线。参照文献[17-18]分别称取没食子酸0.1 mg、绿原酸6 mg、咖啡酸0.6 mg、对羟基苯甲酸0.2 mg、儿茶素0.6 mg、表儿茶素0.6 mg、芦丁0.8 mg、槲皮素0.5 mg、根皮素0.5 mg、根皮苷0.5 mg、槲皮素标准品0.5 mg，分别溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中，混和均匀[12]。分别从以上每种单体酚标准溶液中取出1 mL混合均匀，得到混合标准品。按照混合标准品与70%的甲醇体积为0.1∶1.9，0.2∶1.8，0.4∶1.6，0.8∶1.2，1.2∶0.8，1.6∶0.4，2.0∶0的方法取出混合标准品和甲醇混合均匀，制作7个不同质量浓度的混合标准品[15-17]。从7个不同质量浓度的混合标准品中每个取出1 mL通过0.45 μm的微孔滤膜过滤置于棕色样品瓶中，于4℃下避光保存，待色谱分析。根据每种单体酚标准品的质量浓度及相对应的峰面积得到其标准品的标准曲线。

式中：C1——1.2.2中所制得混合标准品中某标准品的质量浓度，μg/mL；

V——取出的混合标准品体积，mL；

M——称取的对应单体酚标准品质量，μg；

C2——NFC果汁中单体酚质量浓度，μg/mL；

C——根据样品多酚峰面积及相对应标准曲线所得样品质量浓度，μg/mL。

（4）苹果NFC果汁中多酚物质的提取溶剂的选择。参照文献[17-18]，分别用甲醇、乙酸乙酯、乙醇60 mL与苹果清汁20 mL按照3∶1的比例混合后置于锥形瓶中，于温度50℃，功率360 W的情况下超声辅助提取40 min，用离心机以转速5 000 r/min离心15 min，取上清液用真空旋转蒸发仪在40℃的条件下进行旋蒸至干，用氮吹仪进行氮吹后，用100%的甲醇进行复溶，最后定容至5 mL的棕色容量瓶中。取出1 mL通过0.45 μm的微孔滤膜过滤，收集到棕色的样品瓶中，待液相色谱进样分析。根据HPLC图谱峰面积及所得到的标准曲线计算样品中各种单体酚的质量浓度，通过比较样品中各种单体酚物质的含量选择最优的提取溶剂为甲醇。

（6）方法学验证。精密度、稳定性、加标回收率参照文献进行，所有峰相对保留时间的RSD均在1%以内，相对峰面积的RSD均在3%以内，说明仪器精密度、稳定性良好，该方法可行。各组分的加标回收率计算如公式（3）。

式中：M1——实测值，将所测得单体酚的峰面积带入对应1.2.2方法所得的标准曲线得到NFC果汁浓度，乘以体积20 mL得到样品中多酚实际含量，mg；

M2——样品中原本所含质量，根据1.2.2方法所得样品未加入标准品之前中原本所含有的各种单体酚的质量，mg；

M3——添加量，向20 mL样品中加入的单体酚质量，mg；

Y——加标回收率，%。

1.3 数据统计分析

所有分析进行3次平行试验。使用Origin 8.0和SPSS 12.0软件进行数据分析，结果表示为平均值±标准偏差（SD），p＜0.05被认为是影响显著。主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）被用作评估每个数据集以检测潜在异常值的探索性技术。

2 结果与分析

2.1 不同品种苹果汁多酚的分析结果

2.1.1 混和标准品HPLC图谱与标准曲线的制备

按照1.2.2（3）方法进行试验，根据HPLC图谱里出峰的情况不断调整洗脱程序，得到分离度较好的混合标准品图谱，确定最终的洗脱程序方法，通过HPLC检测得到11种单体酚标准品混合物的HPLC图。

对83例胃癌患者的性别，肿瘤的位置、直径、Borrmann分型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和远处转移，以及新辅助化疗和 CTC阳性等指标，进行COX单因素和多因素回归分析。结果发现，胃癌患者术后生存的独立影响因素为肿瘤分化程度、新辅助化疗和 CTC阳性这3项指标（P值分别为0.035、0.011和＜0.001，表2和表3）。

多酚洗脱程序见表1，11种多酚混合标准品的高效液相色谱图见图1。

图1 11种多酚混合标准品的高效液相色谱图

表1 多酚洗脱程序

根据11种单体酚标准品的保留时间判断混合标准品中各个色谱峰所对应的单体酚种类，HPLC图峰依次为没食子酸-保留时间为8.859 min，4-羟基苯甲酸-保留时间为23.898 min，绿原酸-保留时间为29.326 min，咖啡酸-保留时间为33.998 min，儿茶素-保留时间为38.383 min，表儿茶素-保留时间为44.854 min，芦丁-保留时间为68.660 min，槲皮素-保留时间为69.390 min，槲皮苷-保留时间为73.722 min，根皮苷-保留时间为78.896 min，根皮素-保留时间为80.743 min。

根据1.2.2（4）采用外标法对分别对选取的11种多酚标准品进行线性回归分析。准确取混合标准品0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，用70%甲醇添至2 mL，通过0.45 μm的滤膜过滤，进行高效液相色谱法检测，最后利用质量浓度和峰面积建立线性回归方程。

单体酚标准品线性回归方程见表2。

表2 单体酚标准品线性回归方程

2.1.2 10个品种的苹果NFC与FC果汁样品中多酚的种类与质量浓度

根据1.2.2（5）方法可以得到样品色谱图中所含有多酚的种类，再根据样品中多酚的峰面积和标准曲线，对10个品种的苹果NFC与FC果汁样品的数据进行处理分析，得到所有样品中多酚的质量浓度与种类，结果以平均值±标准偏差表示。

10个品种的苹果NFC果汁样品中多酚的种类与质量浓度见表3，10个品种的NFC苹果汁（a）与FC苹果汁（b）的高效液相色谱图见图3，10个品种的苹果FC果汁样品中多酚的种类与质量浓度见表4。

由表3可知，10个品种的苹果NFC果汁样品都含有4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、槲皮素这5种多酚物质，且在质量浓度上具有显著性差异；其中绿原酸在10个品种的苹果NFC果汁样品中含量最多；试验所有样品中不含有两种多酚物质即根皮苷、根皮素。

表3 10个品种的苹果NFC果汁样品中多酚的种类与质量浓度/μg·mL-1

由表4可知，与相同品种NFC苹果汁相比较，FC苹果汁中的多酚种类和含量明显减少，在寒富品种FC果汁中出现了根皮素，在乔纳金、自由、延光、富士品种的FC的苹果汁中出现了根皮素和根皮苷2种酚类。

表4 10个品种的苹果FC果汁样品中多酚的种类与质量浓度/μg·mL-1

NFC苹果汁的多酚种类和含量明显多于FC苹果汁，绿原酸在10个品种的苹果NFC果汁样品中都是含量最高，没食子酸在10个品种NFC果汁样品中出现（在红富士苹果NFC果汁中质量浓度最高，在黛绿苹果NFC果汁中含量最低），儿茶素仅在华硕、延光、首红、元帅这4个品种NFC果汁样品中出现（含量最高是元帅苹果），芦丁在富士、首红、乔纳金、元帅这4个品种NFC果汁样品中出现（含量最高是元帅苹果），槲皮苷仅在延光、富士、寒富、元帅这4个品种NFC果汁样品中出现（含量最高是延光苹果）；对羟基苯甲酸、咖啡酸、槲皮素分别在橘苹、首红、延光苹果NFC果汁中含量最高。

FC苹果汁中的多酚种类和含量明显减少，但乔娜金苹果FC苹果汁中还含有10种多酚物质，黛绿品种的FC果汁中绿原酸相比于NFC果汁来说并未损失，这一点直观地体现在图3（a）和图3（b）中。毋庸置疑，不同品种苹果的NFC中多酚种类与质量浓度存在较大差异，而相同品种NFC和FC果汁中多酚的种类与含量也会产生很大变化，且FC果汁中由于浓缩工艺等加工方式等方面对多酚的影响，使得果汁中一些多酚物质发生降解等反应而出现新的多酚成分[11，13]。因此，如果NFC果汁中出现了根皮素和根皮苷两种酚类，即可认为是FC果汁掺假。当然，还需要继续增加苹果加工品种为20～30种进行NFC、FC苹果汁中多酚成分分析，就可得到更有说服力的证据。

图2 10个品种的NFC苹果汁（a）与FC苹果汁（b）的高效液相色谱图

2.2 方法学验证结果

在精密度试验中选取绿原酸作为参照物质将其保留时间定为1，选取表儿茶素作为参照物质将其峰面积定为1，计算得出其他物质的相对保留时间及相对峰面积，连续5次进样每次所得的HPLC图谱数据（表5）知，多酚物质相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3%，说明高效液相色谱机的精密度良好。稳定性试验（表6）得到的结果，也是每种多酚物质相对保留时间稳定性的RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3%。稳定性相对保留时间RSD小于1%，说明高效液相色谱机稳定性良好。加标回收率试验，得到的结果也比较好，加标回收率除绿原酸之外，均在90%以上，说明试验的提取方法和高效液相检测方法良好。

试验方法精密度分析见表5。

表5 试验方法精密度分析

3 结论

（1）以甲醇为提取剂超声辅助提取苹果汁多酚，10个苹果品种的NFC果汁都含有4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、槲皮素5种多酚物质（含量最高的是绿原酸），且在质量浓度上具有显著性差异；试验样品中不含有根皮苷、根皮素2种多酚物质。

（2）与相同品种NFC苹果汁相比较，FC苹果汁中的多酚种类和含量明显减少。寒富品种的FC果汁中出现了根皮素，在乔纳金、自由、延光、富士品种的FC苹果汁中出现了根皮素和根皮苷2种酚类；该结果可作为辨别NFC果汁掺假的重要依据。该方法可能成为NFC果汁掺假检验中追溯苹果制品种源的有用工具。

试验方法稳定性分析见表6。

表6 试验方法稳定性分析