水母生物毒素提取纯化及其生物活性研究进展

吴金辉，吕 喆，张重阳*，刘志亮，杜 彬*，杨越冬*

(1 河北省天然产物活性成分与功能重点实验室，河北 秦皇岛， 066004；2 秦皇岛市第一医院急诊科；3 河北科技师范学院海洋科学研究中心)

水母属于刺胞动物门，钵水母纲，是刺胞动物的代表物种[1]。刺细胞是刺胞动物所特有的1种攻击和防卫性细胞，每个刺细胞均有1种特殊的细胞器——刺丝囊[2，3]，不同体积和形态的刺丝囊可能储存不同生物活性的毒液，囊中有毒液和盘绕的刺丝，刺细胞外侧有刺针，受到物理或化学刺激时，刺丝以及毒液随着刺针立即射出，蛰伤对方，水母从而捕食猎物或保护自己[4，5]。人类皮肤被蛰伤后常见的症状为皮肤炎症反应如红肿、瘙痒等，严重者会导致全身中毒反应甚至死亡[6～8]。水母中除了含有毒素之外，还含有多种生物活性物质，如多糖[9], 胶原蛋白肽[10，11]等。

水母生物毒素具有广泛的生物活性，比如抗氧化，治疗心血管疾病、糖尿病和抗癌等[12～16]。但是关于水母生物毒素的一些关键科学问题尚未搞清楚，如高效提取方法、高效纯化技术、毒素的本质、毒素蛋白的种类、毒素的活性、毒素作用机理等[17～21]。因此，从水母中提取毒素，纯化出高生物活性毒素是水母毒素领域研究的关键。笔者对近些年有关水母生物毒素的文献进行系统的综述，主要侧重水母生物毒素的提取制备、分离纯化和生物活性，旨在为水母生物毒素的复杂分子机制提供理论依据和技术支持，为治疗水母蜇伤和进一步开发新型海洋天然药物提供科学依据。

1 提取制备方法

1.1 触手直接破碎提取法

储存水母毒素的刺细胞主要生长在水母触手上，于是，在认知较浅，仪器短缺的早期研究中，直接碾碎水母触手来提取粗毒，再研究粗毒的毒性，是当时较适合的提取方法，此法为人类研究水母毒素迈出了第一步。但是，此法导致提取的粗毒中杂质太多，过多的杂质使毒素纯化困难，从而无法深入研究毒素活性和作用机制等关键问题，所以现在几乎不再使用此法[20]。

1.2 刺丝囊破碎提取法

刺丝囊是1种刺细胞内特殊细胞器，是水母唯一能够储存毒液的细胞器。刺丝囊破碎提取法是目前应用最广的水母毒素提取方法，即通过水母触手自溶，刺丝囊脱落，再将刺丝囊分离收集，再进行破碎，从而提取杂质明显更少的毒素的方法。破碎刺丝囊的方法包括：超声波破碎法，研钵破碎法，组织研磨器破碎法等。相比触手直接破碎提取法，此方法避免了触手杂质的干扰，优化了提取的效率，有利于毒液纯化和研究毒素本质，以及深入研究不同毒素活性。但是，此法仍存在刺丝囊杂质干扰，破碎刺丝囊过程中易产热影响毒素活性等问题。

不同体积形态的水母刺丝囊可能含有不同的有毒成分。Wang等[22]改进了以往的方法制备不同体积形态的刺丝囊，通过自溶触手分离刺丝囊，刺丝囊在不连续梯度percoll细胞分离液中离心，将不同体积形态的刺丝囊分离，然后去除Percoll细胞分离液，收集不同体积形态的刺丝囊，保存在-80 ℃用于后续提取不同毒液。这种改进的分离刺丝囊的方法虽然对减少杂质帮助不大，但是对于从刺丝囊提取毒素的纯化影响深远，同一水母不同刺丝囊的毒素差别不大，提取的所有刺丝囊共同破碎取得的毒液必然难以纯化，于是这种先分离不同类型刺丝囊，然后再分别提取毒液的方法就有了极大的研究和应用意义。

1.3 超低温刺激刺丝囊提取法

低效率的传统分离和纯化方法妨碍了从水母中大规模鉴定新毒素和生物活性成分[23]。超低温刺激刺丝囊提取法是采用-80 ℃的超低温冷冻水母触手，刺激刺丝囊释放毒液。此法无需破坏刺丝囊，减少了杂质混入，而且操作在低温下进行，有利于保持毒素活性，为水母毒素进一步纯化和活性研究奠定了基础。

薛伟等[24]改进了白色霞水母毒素提取方法，采用超低温冷冻水母触手，刺激刺丝囊释放毒液，得到粗毒，然后通过阴离子交换层析(DEAE Sepharose)和凝胶过滤层析(SephadexG-200)最终分离纯化得到分子量为45 ku的毒素蛋白。此法为难以分离刺丝囊的水母和提取极其不耐热的水母毒素提供了一个新思路。

1.4 剧烈机械震荡刺激刺丝囊提取法

剧烈机械震荡刺激刺丝囊提取法采用剧烈机械震荡处理水母触手，通过物理法刺激刺丝囊释放毒液，得到水母生物毒素粗毒。常银龙[25]通过剧烈机械震荡刺激刺丝囊，使大部分刺丝囊释放毒液，简便地得到了水母毒液。该方法也不会破坏刺丝囊细胞，减少了杂质的混入，操作较简便，适合于产量较低的粗毒提取制备阶段。但是毒液纯化依旧很困难，难以纯化的毒液是鉴定毒素成分和生物活性的首要问题。

1.5 乙醇刺激刺丝囊提取法

由于从刺丝囊中提取足量毒素的技术存在困难，水母生物毒素的研究一直落后于其他毒理学领域。Mahdokht等[26]报道了一种新型的快速、有效、可重复的水母毒素制备方法，即用乙醇诱导刺丝囊排出毒液，一步回收毒素。以乙醇刺激刺丝囊释放毒素，再以乙醇作为提取溶剂来提取水母毒素，与传统方法——外力直接破碎刺丝囊或触手提取毒素法相比，刺丝囊细胞未受到破坏，毒素完整性得以保存，混入蛋白质杂质减少，操作便捷，乙醇可重复使用，实验成本低，为水母毒素进一步分离纯化、结构鉴定和活性研究奠定了基础。

但是，乙醇刺激刺丝囊提取法也有其缺点。Cantoni等[27]比较了盐水提取方法和体外化学诱导释放毒素2种技术。大小排斥层析显示，2种方法的毒液图谱有明显差异：盐水回收法的FPLC图谱和SDS-PAGE凝胶与以前发表的结果相似，而乙醇诱导的方法则不同。SDS-PAGE凝胶显示盐水法回收的先前鉴定的心脏毒性蛋白有明显的40～55 ku条带，而乙醇诱导的方法则产生降解的毒蛋白条带。通过xCELLigence实时细胞分析(RTCA)产生的浓度-反应曲线显示，当通过盐水排放恢复的毒液作用于这些细胞时，人心肌细胞的活性急剧下降。除1个样本外，所有乙醇诱导的回收毒液在应用于人心肌细胞时均不能引起细胞存活率的浓度依赖性下降，导致比较的毒液样本之间的IC50有显著差异。此研究有助于更好地理解在未来水母毒素提取研究中开发和利用新技术所必需的参数和分析，与盐水降解触手和组织研磨器提取毒液的方法相比，乙醇刺激刺丝囊提取方法具有一定的局限性。水母生物毒素的不同提取制备方法以及优缺点见表1。

表1 水母毒素的提取制备方法及其优缺点

2 分离纯化方法

水母生物毒素的主要成分是蛋白质和多肽，因此水母毒素的分离纯化大多采用蛋白质分离纯化手段。根据蛋白质分子性质不同，用于水母生物毒素分离纯化的方法主要有：凝胶过滤层析，蛋白质盐析分离，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析，快速蛋白液相层析等。

Bae等[28]采用DEAE阳离子交换柱分离得到沙海蜇中具有纤溶活性的毒素成分，分子量约为70，35，30和28 ku，这些毒素被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟完全阻断，所以这些毒素可以判断是具有纤溶活性的类糜蛋白酶丝氨酸蛋白酶。这些信息可能有助于开发水母环境的临床管理和未来治疗血栓性疾病的药物。

Frazão等[29]利用1D SDS-PAGE和2DE对夜光游水母体蛋白质进行分离，然后利用纳米LC-MS/MS和MALDI-TOF/TOF技术对其进行表征。2种方法共检测出68种不同的蛋白质，首次鉴定得到1种锌金属蛋白酶、1种红色荧光蛋白(RFP)和1种过氧化物酶，其中锌金属蛋白酶具有ShK毒素结构域，与夜光游水母的蜇伤毒性作用有关。

Choudhary等[30]探索了一种蛋白质组学方法来鉴定沙海蜇成分及其与水母蜇伤引起的病理效应的相互关系。Choudhary利用二维凝胶电泳和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI/TOF/MS)技术，共鉴定出150种蛋白质。这为理解沙海蜇毒液中毒机制提供了重要的信息，为新的蛋白质发现和开发处理水母蜇伤人类的实用方法提供理论支持。

3 生物活性研究

水母生物毒素一般对人体产生神经毒性、溶血性、心脏毒性、皮肤肌肉毒性等[32]；但在特定条件下，也具有友好医学生物活性，比如抗菌、止痛、抗凝血、抗氧化和抗肿瘤等[33]。

3.1 友好生物活性

3.1.1酶活性 Yue等[34]通过生物化学和动力学分析了沙海蜇和白色霞水母毒素的酶学性质。结果显示，毒素表现出多种酶活性，其中金属蛋白酶活性和类PLA2s活性占主导。金属蛋白酶和类似PLA2s的催化活性取决于不同的物理化学条件，如温度，pH和二价离子。动力学分析表明，它们在特定条件下的催化行为符合Michaelis-Menten方程。水母刺丝囊毒素具有多种酶促成分，这可能是水母生物毒素具有广泛特征的生物活性的基础。该研究将有助于理解水母刺丝囊毒素的酶促成分和毒性，并可能为开发用于水母蛰伤的药物提供潜在的治疗靶标。

3.1.2抗氧化性 Frazão等[29]利用1D SDS-PAGE和2DE对夜光游水母体蛋白质进行分离，然后利用纳米LC-MS/MS和MALDI-TOF/TOF技术对其进行表征。在夜光游水母毒液中鉴定出1种过氧化物酶，具有较强的抗氧化和抗紫外线辐射能力，使其成为抗氧化剂和抗紫外线辐射剂的新的自然资源。

3.1.3纤溶活性 Bae等[28]采用金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂进行纤维蛋白谱分析，研究沙海蜇的丝状蛋白酶及其组成特征，探讨沙海蜇的纤溶活性与丝氨酸蛋白酶活性的关系。结果显示：沙海蜇毒素具有纤溶活性，分子量约为70，35，30，28 ku，主要表现为糜蛋白酶样特征。在低pH(<6)和高温(>37 ℃)下，其活性完全消失。部分金属离子(Co2+，Cu2+，Zn2+，Ni2+)对其纤溶活性有较强的抑制作用，而Ca2+和Mg2+则没有抑制作用。沙海蜇毒素中含有一种具有纤溶活性的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，这些信息可能有助于开发水母环境的临床管理和未来治疗血栓性疾病的药物。

3.1.4抗凝血活性 Rastogi等[35]从印度桶状水母触手提取物中分离水母毒素，并研究其抗凝血活性。结果表明，该毒素显示出纤维蛋白原分解特性，对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用。触手提取物还对人的RBC具有显著的溶血活性，对(偶氮)酪蛋白和明胶等底物也具有很强的蛋白水解活性。但是，这种蛋白水解活性完全被金属蛋白酶抑制剂(EDTA)抑制，而未被丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)抑制。

3.1.5抗癌性 Ha等[36]以慢性粒细胞白血病K562细胞为研究对象，以正己烷刺激水母刺丝囊释放毒液，研究沙海蜇正己烷提取的毒液的体外抗癌作用机制，发现毒液对慢性粒细胞白血病K562细胞具有抗癌作用。水母正己烷提取毒液的抗癌活性可能是通过诱导K562细胞中caspases和MAPK的激活，特别是p38的磷酸化，使细胞周期阻滞在GO/G1期而产生介导。该研究填补了水母毒素抗癌活性的空白，为探究海洋生物资源治疗癌症的作用机制和药物研究奠定了理论基础。

Pang等[37]通过A431人表皮癌细胞研究了白色霞水母和沙海蜇刺丝囊粗毒素的细胞毒活性。结果表明，在24 h孵育后，2种水母生物毒素的IC50分别为68.6，40.9 mg/L，来自霞水母的毒液显示出比沙海蜇更强的细胞毒活性。

Morabito等[38]研究发现哺乳动物细胞暴露在夜光游水母刺丝囊毒素中，会显著地改变细胞质膜的离子电导，从而影响细胞体积的调节和维持等稳态功能。毒液诱导的NaCl内流，然后是水和细胞肿胀，很可能是夜光游水母生物毒素杀伤细胞活性的基础。该研究强调了夜光游水母毒液的独特性质，并为其活性化合物的可能用途和毒液中毒的治疗方法提供了必要的信息。

3.2 非友好生物活性

3.2.1肾脏毒性 Li等[39]通过急性毒理学方法和病理学分析，探讨了沙海蜇生物毒素的体内毒性。采用静脉注射，该毒液在小鼠体内的LD50约为2.92 mg/g(按小鼠体质量计)，并引起肾小球肿胀、肾小泡狭窄、肾小管扩张、肝血窦扩张、肺水肿和恶性胸腔积液。病理切片分析显示肾脏和肝脏明显受损，但心、脾、胃未见明显改变。此外，注射毒液后，小鼠还表现出抽搐，口腔出血，竖毛，呼吸困难和死亡。该毒素对小鼠肾脏有很强的毒性，急性肾功能衰竭可能是严重蜇伤后死亡的最重要因素之一。

3.2.3致炎性 抑制炎症反应是治疗水母蜇伤的关键，探索水母生物毒素中引起炎症反应的主要成分是一个亟待研究的领域。Li等[41]从细胞水平探讨了基质金属蛋白酶抑制剂对毒液诱发的炎症的抑制作用。以沙海蜇刺丝囊毒液抑制剂治疗后，在人角质化细胞和人类胚胎皮肤成纤维细胞2种皮肤细胞系中，3种炎症因子IL-6，MCP-1和TNF-α被确定。结果表明，基质金属蛋白酶抑制剂能显著降低沙海蜇刺丝囊毒液对皮肤细胞的毒性作用。IL-6，MCP-1和TNF-α在细胞内的表达水平也明显降低，这表明基质金属蛋白酶可能是导致水母皮炎的重要因素。本研究对水母蜇伤的预防和治疗有一定的参考价值。

Bruschetta等[42]验证夜光游水母生物毒素是否能诱发大鼠体内的炎症和氧化应激反应。在第一组实验中，给动物注射粗毒液(以6，30，60 μg/kg等3种不同剂量，悬浮在盐溶液中，静脉注射)，以测试死亡率和可能的血压变化。在第二组实验中，为了证实夜光游水母粗毒能促进ROS的形成，并可能有助于炎症的病理生理学，注射粗毒液的动物(30 μg/kg)也用强抗氧化剂四甲基哌啶(100 mg/kg，注射粗毒液后30，60 min)进行处理。注射粗毒液后，四甲基哌啶导致与炎症相关的各项参数显著降低。结果证实夜光游水母毒素在全身炎症过程中的潜在作用，增加了关于其生物活性的新信息。四甲基哌啶通过抑制NF-κB p65阻止了抗凋亡途径的丧失，并减少了促凋亡途径的激活。

3.2.4溶血活性 Yue等[43]采用凝胶内酶谱和液相色谱串联质谱相结合的方法对沙海蜇酶毒素进行功能鉴定，利用特异性抑制剂研究了金属蛋白酶和脂肪酶在溶血活性中的潜在作用。结果表明，刺丝囊毒素具有蛋白酶、脂肪酶和透明质酸酶类活性。液相色谱串联质谱的蛋白质组学方法结果显示，酶谱中观察到的蛋白水解带与现存的锌金属蛋白酶裂解酶和虾红素金属蛋白酶具有序列同源性。与暴露于毒液的绵羊红细胞相比，金属蛋白酶抑制剂巴马司他与沙海蜇刺丝囊毒液预孵育后，溶血率降低了约62%，这表明金属蛋白酶有助于溶血活性。此外，在凝胶覆盖试验中，分子量在14～18 ku范围内的毒素表现出卵黄和红细胞溶解活性。该研究首次证实了水母毒素金属蛋白酶的作用，并提示脂肪酶参与了溶血活性。对这种关系的研究将有助于更好地了解水母毒素的成分和毒性。

Pang等[37]发现白色霞水母和沙海蜇刺丝囊中粗毒液具有溶血活性。与沙海蜇相同长度的触角相比，白色霞水母触角上的刺丝囊数量更多。从沙海蜇提取的每个刺丝囊中的蛋白质浓度均高于白色霞水母的蛋白质浓度。2种刺丝囊毒液均对鸡、鸽子和绵羊的红细胞显示出剂量和时间依赖性的溶血活性，其中绵羊的红细胞最敏感，在暴露于沙海蜇的30 min后，EC50为69.69，63.62 mg/L。

Brinkman等[44]采用绵羊红细胞溶血作为细胞溶解活性的指标，分离了澳大利亚箱形水母中2种主要的溶血素，其分子量分别为370和145 ku，以及一种较小的溶血素(约70 ku)。SDS-PAGE和蛋白质印迹蛋白图谱表明370 ku溶血素由CfTX-1和CfTX-2亚基组成(分别约为43 ku和45 ku)[44]。

3.2.5致命性 水母毒液由多种毒素组成，而致命毒素是水母毒液中毒性最强、最危险的成分，是水母蜇伤和中毒致人死亡的主要原因。Li等[45]采用毒理学分析、蛋白质组分析和纯化相结合的方法研究了霞水母生物毒素的致命性。结果显示，心脏中毒包括急性心肌梗死，心率和血压的显著下降。共鉴定出316和374个同源蛋白，包括磷脂酶A2样毒素和金属蛋白酶毒素。此外，还证实了水母毒素的致命性与金属蛋白酶活性有关，而与磷脂酶A2活性和溶血活性无关。综上所述，该研究不仅为了解水母毒液的致命性机制提供了全面的信息，也为严重水母蜇伤的治疗或抢救策略提供了非常有用的信息。

以前研究在沙海蜇毒液中发现了数百种毒素，但是目前还不清楚哪种毒素是致命的。Li 等[46]采用HiLoad 16/10SP Sepharose High Performance阳离子交换层析法和HiLoad 16/60Superdex 75体积排斥层析法结合使用的多重层析法，从沙海蜇毒液中分离出致命组分。致命组分对小鼠有较强的致命性，毒理学结果与沙海蜇蛰伤后死亡患者的临床症状相一致，表明致命组分含有毒液中的关键致命毒素。此研究促进了人们对水母毒液致命性的认识，为治疗水母蛰伤提供了理论依据，对今后治疗这种水母蛰伤的药物开发具有重要意义。

3.2.6心脏毒性 Chaousis等[47]首次发现了箱形水母中3种不同的生物毒素粗组分。通过基于阻抗的测定法监测人类肌肉细胞的生存能力，采用细胞增殖测定法测量其细胞毒性，得出细胞毒性与细胞代谢的减少相关。比较毒素成分对人心肌细胞和人骨骼肌细胞的影响，结果发现，2种组分特异性地影响具有不同时间特征的心肌细胞(CTF-a和CTF-b)。与CTF-b相比，CTF-a在较低浓度时活性增强，可引起快速但短期的细胞脱离和细胞代谢降低。这种活性不是永久性的，当暴露于除CTF-a测试的最高浓度之外的所有浓度时，观察到细胞再附着和随后的心肌细胞代谢增加。与CTF-a相比，CTF-b对细胞的细胞毒性作用时间是后者的2倍，这种活性具有永久性。此外，2种组分的组合具有协同效应，比每种毒素的单独效应的总和更强和更快地导致细胞分离或死亡。

4 研究展望

气候变化、食品和饮用水安全、商业驱动和技术发展是影响毒素学的四个重要的方面。然而，对于水母生物毒素研究，目前尚不清楚存在多少种毒素以及什么类型的毒素，另外，临床症状与毒素之间的关系也不明确。在今后的研究中，增加鉴定毒素的数量和类型变得至关重要。此外，改良的组学技术可以从基因组或毒液中鉴定毒素，有助于鉴定新的天然分子，这些分子将会成为更有效的药物先导化合物。总之，考虑到水母生物毒素的双重生物活性，具有结合亲和力和出色靶标特异性的生物毒素可以成为基础细胞科学和医学的有力工具。