黄瓜优良组合‘SH23’DNA指纹图谱构建及种子纯度鉴定

陈鸿鸵，宋晓飞，李晓丽，闫立英

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066600)

黄瓜种子质量的优劣程度直接影响其品质和产量。随着市场需求量越来越大，黄瓜新品种选育应用取得较快进展，因此，快速、有效的鉴定黄瓜种子的纯度和真实性十分必要。DNA分子标记鉴定技术中，SSR标记技术是较成熟的构建DNA指纹图谱的技术[1]。SSR分子标记具有信息含量高、稳定性好、呈共显性遗传和操作简单等优势。在粮食作物中，采用SSR分子标记技术对种子纯度的鉴定的研究相对较多[2～5]。对果蔬的种子纯度鉴定相对滞后，但近几年，辣椒、大白菜、西瓜、甜瓜、黄瓜[9]等品种指纹图谱的构建也日渐增多[6～9]。任国良等[10]采用分离群体分组分析法(BSA)对黄瓜无侧枝基因nlb进行定位，利用SSR分子标记将nlb基因定位于第1条染色体，紧密连锁的分子标记为SSR19673。Zhang等[11]利用SSR标记对黄瓜自交系9110Gt和9930杂交RIL群体进行定位，将黄瓜叶片和果实苦味基因Bi-3和Bi-1别定位在第5和第6条染色体上。SSR分子标记技术是指纹图谱构建和种子纯度鉴定的重要手段。本研究利用SSR分子标记技术，用100对SSR引物对‘SH23’及其亲本和对照品种进行特异标记筛选，构建指纹图谱，并进行品种纯度鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

以河北科技师范学院黄瓜课题组选育出的旱黄瓜优良组合‘SH23’及其父本、母本，对照品种‘绿岛7号’和山海关当地品种为试材，进行‘SH23’指纹图谱构建及种子纯度鉴定。于2020年10月30日田间随机选取‘SH23’100个单株，父本、母本各10份，对照品种各1份，取近生长点处幼嫩叶片，提取基因组DNA。

1.2 试验方法

1.2.1DNA提取 采用CTAB法提取黄瓜‘SH23’的父本和母本、‘SH23’100个单株、‘绿岛7号’和山海关当地品种新鲜健康幼嫩叶片中的基因组DNA，用10 g/L的琼脂糖凝胶检测DNA质量，使用酶标仪(Gene Company Limied 基因有限公司生产，型号为Sybergy HT)测定DNA浓度及OD值，并将DNA稀释到50 mg/L，4 ℃保存备用。

1.2.2PCR扩增 SSR反应体系为20 μL，包括1 μL模板DNA(50 mg/L)，10 μL 2×Taq PCR Mix(包含Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+)，7 μL ddH2O，正反向引物各1 μL。SSR扩增程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35次循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3电泳检测及指纹图谱构建 采用60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，60 W电泳45 min后检测PCR扩增产物，银染显色处理，拍照记录结果。寻找扩增条带清晰的多态性引物，根据电泳结果用0，1记录条带的相对位置，条带清晰的记为1，缺失的则记为0，得出相应的分子指纹图谱。

1.2.4种子纯度鉴定 利用筛选出的具有多态性的SSR引物对100株‘SH23’进行种子纯度鉴定，观察带型表现，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱构建

用100对黄瓜全基因组覆盖的SSR引物对‘SH23’及其亲本和对照品种DNA进行PCR扩增以及电泳分离。扩增后电泳检测显示100对引物中有5对引物(SSR13033，SSR02166，SSR03527，SSR14084，SSR19672)在亲本间有多态性(表1)，多态性比例为5%。这 5对引物扩增出的条带可以明确的区分出F1和亲本(图1)。

图1 多态性引物SSR13033，SSR14084，SSR19672，SSR03527，SSR02166电泳条带注：1为SH23，2为母本，3为父本，4为绿岛7号，5为山海关当地品种

表1 多态性SSR引物及其序列

这5对引物组成了‘SH23’及其亲本的DNA指纹图谱(表2)。指纹图谱的构建为种子纯度鉴定及新品种保护提供依据。

表2 ‘SH23’及亲本SSR指纹图谱

2.2 种子纯度鉴定

用引物SSR19672对随机选取的100株F1进行纯度鉴定。结果显示，该引物在全部F1植株中均扩增出双亲条带的杂合带型(图2)。因此，SSR分子标记鉴定表明种子纯度鉴定结果为100%。

图2 引物SSR19672对‘SH23’扩增条带

3 结论

目前随着黄瓜新品种选育进展加快，商业化品种日益增多，随之市场上出现了很多同名异物现象，不仅扰乱了市场，也常常给育种者和种子经营者带来了不利影响。分子指纹图谱的构建既能为品种的真伪做出鉴别同时也能为黄瓜品种的登记审定提供技术支持。另外，常规种子纯度鉴定方法费时费力、易受环境、时间条件影响，DNA分子标记鉴定的方法省时省力、多态性水平高。

本次研究利用稳定性好、多态性丰富、简单操作的SSR分子标记技术，用100对全基因组覆盖的SSR引物，对新选育的黄瓜优良组合‘SH23’及其亲本、对照品种进行多态性引物筛选，结果筛选出5对(SSR13033，SSR02166，SSR03527，SSR14084，SSR19672)引物在‘SH23’和亲本、对照品种间具有多态性，条带清晰、易识别且稳定，这5对引物组成了‘SH23’及其亲本的DNA标记指纹图谱，能够有效鉴别出‘SH23’和其他品种。可为该品种的真伪鉴别提供依据和技术支持。

利用筛选出的多态性引物SSR19672对随机选取的100株‘SH23’植株进行纯度鉴定表明，‘SH23’的种子纯度为100%。