DHM抑制海马内质网应激改善T2DM大鼠认知功能障碍

李梦伟，吕慧婕,2，王紫涵，罗金定，丁星星，何剑琴，杨丝丝，奉水东，凌宏艳

(1. 南华大学衡阳医学院生理学教研室，湖南 衡阳 421001；2.吉首大学体育科学学院，湖南 湘西 416000； 3. 南华大学船山学院，4. 南华大学公共卫生学院社会医学与卫生事业管理学教研室，湖南 衡阳 421001)

随着当代经济快速发展，糖尿病患者逐渐增长。糖尿病会累及中枢神经系统、导致认知功能损害，表现为学习记忆能力下降，从而影响人们的正常生活。研究发现，糖尿病认知功能障碍的机制可能是由于脑血管病变以及线粒体功能障碍，氧化应激等因素损害神经元[1]，也有研究表明，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可导致海马损伤，从而导致认知功能障碍的发生[2]。

DHM(dihydromyricetin，DHM)是一种多酚羟基二氢黄酮类化合物，研究表明DHM具有抗炎、抗氧化及对神经系统疾病保护作用[3]。又有研究发现，格列齐特联合二氢杨梅素可使葡萄糖稳态、血脂状况和炎症状态正常化，用于治疗二型糖尿病[4]。Liu等[5]研究显示，斛碱和二甲双胍通过抑制ERS来改善衰老期小鼠的认知功能障碍。Takano等[6]发现，甲氧基黄酮(一种黄酮类化合物)具有抗氧化作用，通过抑制ERS来缓解MIN6细胞的死亡。也有研究发现，二氢杨梅素通过抑制ERS来保护肝细胞氧化损伤[7]。但DHM是否可通过抑制ERS改善2型糖尿病认知功能障碍，未见报道。因此，本研究采用高糖高脂饮食联合低剂量STZ(30 mg·kg-1)建立2型糖尿病大鼠模型，用DHM处理，观察DHM对T2DM大鼠认知功能障碍的影响，并探讨其机制是否与抑制海马ERS有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物7～8周雄性Sprague Dawley大鼠(体质量为260～280 g)由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK(湘)2014-0011。动物房内12 h明暗交替，将温度设为23 ℃～24 ℃，湿度为40%～60%，保证充足的水和鼠粮。实验操作遵照《国家实验动物健康与管理条例》进行。

1.2 实验试剂牛磺熊去氧胆酸(HY-19696)和衣霉素(HY-A0098)购于MCE公司，链脲佐菌素(S0130)购于Sigma公司，二氢杨梅素(27200-12-0)由张家界志诚生物科技有限公司提供，GRP78抗体(GB12098)购于赛维尔公司，p-PERK(SC4332)抗体购于碧云天公司。

1.3 仪器奥林巴斯生物公司的-80 ℃超低温冰箱(MDF-86V838)，其林贝尔生物公司的高速低温离心机(H4-20KR)、摇摆型脱色摇床(TS-1型)，美国Bio-Rad公司的电泳槽/转印槽(1703930)。

1.4 T2DM大鼠模型的建立及实验分组116只雄性SD大鼠分笼适应性喂养1周，随机选出56只作为正常对照组：普通饲料喂养，其余大鼠为2型糖尿病模型组(T2DM组，共60只):高糖高脂饲料喂养。4周后，空腹过夜，称重后用三诺血糖仪测定空腹血糖。随后分别一次性腹腔注射无菌柠檬酸盐缓冲液(30 mg·kg-1)或低剂量STZ(30 mg·kg-1)，接着普通饲料或高糖高脂饲料喂养，4周后，大鼠进行空腹血糖和血清胰岛素(Elisa方法)检测，当空腹血糖>16.7 mmol·L-1时则2型糖尿病大鼠模型建立成功(造模过程中死亡2只，失败2只)。随后2组大鼠分别用双蒸水(1次/天，灌胃)或用DHM处理(250 mg·kg-1·d-1，灌胃)12周。12周后，每组随机选取8只进行水迷宫和Y迷宫检测。各组剩余大鼠进行侧脑室置管给药，实验分组如下：

1.4.1观察ERS是否参与T2DM大鼠认知功能障碍 Control组和T2DM组大鼠分别在行为学检测前3 d侧脑室置管注射与ERS拮抗剂牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA，10 μg·d-1)等体积的生理盐水或TUDCA，每天1次，连续3 d，因此实验分为4组：Control组、T2DM组、Control+TUDCA组和T2DM+TUDCA组(n=8)。

1.4.2观察DHM对T2DM认知功能改善作用是否与ERS有关 Control组、T2DM+DHM组大鼠分别在行为学检测前1天通过侧脑室置管注射与ERS激活剂衣霉素(tunicamycin，TUN，10 μL)等体积的生理盐水或TUN，T2DM组于同一时间注射与TUN等体积的生理盐水，Control+DHM组注射TUN(10 μL)。因此实验分为6组：Control组、T2DM组、T2DM+DHM组、Control+TUN组、Control+DHM+TUN组、T2DM+DHM+TUN组(n=8)。

1.5 血糖测量大鼠禁食过夜，12 h后采血针刺破大鼠尾部流出静脉血，用三诺血糖测试仪测量空腹血糖。

1.6 血清胰岛素测量取大鼠尾巴静脉血，在 13 000 r·min-1离心30 min后取血清，用大鼠胰岛素Elise试剂盒进行血清胰岛素水平的检测。

1.7 行为学实验Y迷宫实验：Y迷宫有三个等长互为120°的臂，将大鼠放入一个臂末端，在3个臂中自由活动5 min，录像记录5 min内每只大鼠的入臂穿梭总次数。交替数为进入Y迷宫3个臂为1次，Y迷宫的统计值是自发交替率，其计算公式为：交替率/%=[(交替数)/(入臂总次数-2)]×100。

水迷宫实验：本实验将一个圆形水池等分为4个扇形象限，水温控制在22 ℃左右，水中加入二氧化钛，搅拌使水不透明呈乳白色，将一个平台放在第一象限中央，其顶部距离水面1 cm。d 1～5是获得性训练期，每天同一时间将大鼠放入水中，记录大鼠到达平台的时间，即为潜伏期。若大鼠潜伏期超过120 s，则人为引导大鼠找到平台并在平台滞留20 s。连续训练5 d，每次训练结束后用干毛巾将大鼠擦干，放回原饲养鼠盒内。D 6是空间探索实验:撤离平台，让每只大鼠放入后自由游泳120 s，摄像记录大鼠经过平台的次数以及运动轨迹。

1.8 侧脑室置管给药大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定在脑立体定位仪，在左侧脑室(以正中线与两耳连线的交点为起点,向后移动0.8 mm,向左移动1.5 mm)插入注射管(插入深度为2.5 mm)并固定在大鼠颅骨上，把药物从注射管中注射到左侧脑室。

1.9 Western blot检测大鼠海马内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK的表达取各组大鼠海马组织30 μg蛋白进行电泳、转膜、封闭后加入抗GRP78、p-PERK抗体，4 ℃摇床过夜后洗涤再加入二抗，接着加入ECL化学发光试剂(1 ∶1)进行反应。曝光后进行扫描，用图像分析软件进行分析。

2 结果

2.1 成功建立T2DM大鼠模型如Fig 1：T2DM组大鼠血糖>16.7 mmol·L-1，Elisa结果显示：T2DM组血清胰岛素明显高于Control组大鼠，说明T2DM大鼠模型成功。

Fig 1 Blood glucose and insulin levels in control and T2DM rats n=56)

2.2 DHM改善T2DM大鼠认知功能障碍Y迷宫实验结果显示：与对照组相比，T2DM组大鼠自发交替率明显减少；而DHM明显增加了大鼠的自发交替率(Fig 2A)；各组大鼠自发运动无明显差异(Fig 2B)，提示：DHM可改善T2DM大鼠学习记忆障碍。Fig 3A显示d 1和d 5各组大鼠的游泳轨迹。与T2DM组相比，T2DM+DHM组大鼠逃避潜伏期减少，停留的时间百分比以及穿过目标象限的次数明显增加(Fig 3B-D)；提示二氢杨梅素可改善T2DM大鼠空间记忆能力。此外，各组大鼠逃避潜伏期和游泳速度没有差异(Fig 3E，F)。综上所述，DHM可改善T2DM大鼠认知功能障碍。

2.3 ERS参与了T2DM大鼠认知功能障碍Y迷宫实验：与Control组相比，T2DM大鼠自发交替率减少,而T2DM+TUDCA组自发交替率明显增加(Fig 4A)；各组大鼠入臂总次数不变(Fig 4B)。表明：TUDCA能够改善T2DM大鼠学习记忆障碍。Fig 5A显示d 1和d 5寻各组大鼠游泳轨迹。与T2DM组相比，T2DM+TUDCA组大鼠逃避潜伏期明显减少，停留时间的百分比和穿过目标象限的次数显著增加(Fig 5B-D)；提示TUDCA可改善T2DM大鼠空间记忆能力。各组大鼠逃避潜伏期和游泳速度无差异(Fig 5E,F)。Western blot结果显示：T2DM+TUDCA组大鼠海马GRP78和p-PERK蛋白的表达明显低于T2DM组(Fig 6)，提示TUDCA能够抑制ERS蛋白的表达。综上证实：TUDCA可改善T2DM大鼠认知功能障碍，即抑制海马ERS能够改善T2DM大鼠认知功能障碍。

Fig 2 Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group of rats n=8)

Fig 3 Comparison of behavioral indexes of Morris water maze in each group of n=8)

Fig 4 Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group of rats n=8)

2.4 DHM改善T2DM大鼠认知功能障碍的机制：抑制海马ERS为进一步探讨DHM改善T2DM大鼠认知功能障碍的机制，我们使用ERS激动剂(TUN)处理，Y迷宫结果显示：与T2DM组相比，T2DM+DHM组大鼠自发交替率明显增加，而与T2DM+DHM组相比，T2DM+DHM+TUN组大鼠自发交替率明显减少(Fig 7A)；各组入臂总次数相同(Fig 7B)，提示：激活海马ERS降低DHM对T2DM大鼠学习记忆障碍的改善作用。Fig 8A显示d 1和d 5各组大鼠游泳轨迹。与T2DM+DHM组相比，T2DM+DHM+TUN组大鼠潜伏期明显增加, 停留时间的百分比和穿过目标象限的次数减少(Figure8B-D)；提示：激活海马ERS可降低DHM改善T2DM大鼠的空间记忆能力。此外各组大鼠逃避潜伏期和游泳速度均没有差异(Fig 8E、F)。Western blot结果显示：T2DM+DHM+TUN组大鼠海马GRP78和p-PERK蛋白表达增加更高于T2DM+DHM组(Fig 9)，说明TUN能够增强T2DM海马内质网应激相关蛋白的表达，即TUN可以促进ERS的发生。上述结果证实：激活ERS能够逆转DHM对T2DM大鼠认知功能障碍的改善作用。

3 讨论

糖尿病是一种常见疾病，目前，糖尿病患病率和发病率急剧增加，糖尿病患者中90%以上是2型糖尿病(Type 2 Diabetes，T2DM)，T2DM会导致多种并发症，如心脏病、脑血管等疾病，糖尿病中后期常伴有周围神经病变、大血管病变等严重并发症。有研究表明，糖尿病患认知功能障碍的风险相对正常人增加超过20%[8]，糖尿病并发认知功能障碍(diabetic cognitive impairment，DCI)引起人们广泛关注，虽然DCI的发病机制尚不清楚，但已证实海马神经元活动异常、氧化应激和星形胶质细胞损伤是DIC的潜在原因[9]，但目前临床上对于DCI的治疗还没有特定的药物。

二氢杨梅素(DHM)是从香叶安眠草茎和叶中提取的类黄酮化合物的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化和清除自由基的能力[10]。我们前期研究证实DHM能够改善高糖诱导的PC12细胞凋亡[11]，表明DHM对神经元的损伤具有有效的保护作用。本实验利用STZ联合高糖高脂诱导2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，接着用DHM处理，结果发现：DHM可改善T2DM大鼠认知功能障碍，随后我们进一步探讨其机制。

Fig 5 Comparison of behavioral indexes of Morris water maze in each group of rats n=8)

Fig 6 The protein expression of Bip and p-PERK in each group of rats n=5)

Fig 7 Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group of rats n=8)

Fig 8 Comparison of behavioral indexes of Morris water maze in each group of rats n=8)

Fig 9 The protein expression of Bip and p-PERK in each group of rats n=5)

内质网应激(ERS)是细胞为应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集等状况,从而激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应等信号途径的反应过程。ERS被认为是多种慢性神经疾病的致病因素，在神经退行性疾病、脑缺血和糖尿病神经病变等神经疾病中有着重要的作用[12]。研究表明，ERS途径参与糖尿病诱导的神经元凋亡，并促进认知功能损伤[13]，并且ERS通路的持续激活会导致神经变性和认知功能障碍[14]；相关研究发现，抑制ERS诱导的炎症反应,可保护高糖诱导的海马神经元损伤,进而提高大鼠的学习记忆能力[15]。Ye等[16]实验研究发现，天麻素通过抑制ERS和NLRP3炎症小体激活改善糖尿病大鼠认知功能障碍；又有研究发现，杨梅素对Caco-2细胞具有保护作用，其保护作用可能与减少ERS，降低caspase-3的裂解有关[17]。我们前期研究发现，二氢杨梅素可能通过抑制氧化应激和增强脑源性神经营养因子的表达，改善2型糖尿病小鼠认知功能障碍[18]。 因此，我们猜测DHM是否可通过抑制海马ERS来改善T2DM大鼠认知功能障碍？本实验结果首先观察到抑制ERS可改善2型糖尿病认知功能障碍，然后使用ERS激动剂作用于DHM处理的T2DM大鼠，结果发现激活ERS可降低DHM对2型糖尿病认知功能障碍的保护作用,提示：DHM可能通过抑制ERS改善T2DM大鼠认知功能障碍。

综上所述，本实验结果表明DHM改善T2DM大鼠认知功能障碍，其机制可能与抑制ERS有关，该研究为糖尿病认知功能障碍的发病机制及防治提供有价值的思路及实验基础。