2020 年云南省边境地区牛蓝舌病血清学调查

寇美玲，杨佳萍，谢佳芮，苗海生

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.施甸县畜牧兽医中心，云南施甸 678200）

蓝舌病（bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的一种通过吸血库蠓传播的虫媒病毒病，牛、羊等反刍动物对其易感，目前尚无有效的治疗方法[1]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其归为一类动物疫病。该病可以引起感染动物发热，鼻腔和胃肠道黏膜卡他性炎症，以及妊娠母畜流产、产死胎等，致死率为20%～30%，对养殖业影响较大[2-3]。目前全球已报道发现27 种BTV 血清型。我国近年来已分离到13 种血清型BTV 毒株[4-9]。BTV 不同血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，因而会产生不同血清型毒株在同一区域混合流行的情况，这给BT 防控带来了极大挑战[10-11]。

云南省位于我国西南边陲，有多个县市与老挝、越南和缅甸接壤，是通往东南亚、南亚的关口，每年有大量牛、羊等家畜通过边境县市进入我国境内。这些边境县市及其相邻的南亚、东南亚国家基本属于亚热带气候，年温差较小，降雨充沛，适于库蠓等媒介昆虫的生长繁殖，因而易于BTV 传播，导致云南省边境地区BT 防控形势较为严峻。

本研究利用BTV C-ELISA 抗体试剂盒，对2020 年从云南省边境12 个县市采集的3 800 份牛血清样品进行抗体检测，以期了解云南省边境地区牛群中的BT 流行情况，从而为其防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

牛血清样品由云南省12 个县市（瑞丽、芒市、陇川、盈江、景洪、勐腊、勐海、澜沧、江城、孟连、西盟、富宁）的动物疫病控制机构采集，共3 800 份。每个县市先按采样点所属地理位置划定采样区域，再将区域内的养殖场、活畜交易市场和散养户分别编号，根据所在地区的实际养殖场户数量，按比例随机抽取养殖场3～9 个、活畜交易市场个1～2 个、散养户1～19 个；场户内，同样根据存栏量按比例通过颈静脉随机采集牛血清样品。各县市具体采样信息见表1。采样地点选择热带、亚热带气候，年平均降雨量较多，年均日照时间较长，相对湿度大，适于媒介昆虫库蠓的生长和繁殖的地区。

表1 云南省12 个县市采样信息统计结果 单位：个/份

1.2 主要仪器和试剂

Multiskan FC 酶标仪，购自Thermo 公司；脱脂奶粉，购自BD difco 公司；BTV C-ELISA 检测试剂盒、PBSTM（磷酸盐缓冲液+Tween 20+脱脂奶粉），为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；PBS 干粉、Tween 20，均购自云南丰科生物科技有限公司。

1.3 血清抗体检测

按照BTV C-ELISA 试剂盒说明书进行检测。取试剂盒提供的ELISA 板，分别取10 μL 被检血清样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照血清加入到相应检测孔和对照孔中，每孔加入50 μL 100倍稀释的竞争抗体，振荡器震荡或轻拍微量反应板，将反应板中的液体充分混匀，在37 ℃温箱里温育30 min；取出板，倒掉孔中的液体，在吸水纸上拍干，每孔加入50 μL 1 000 倍稀释的羊抗豚鼠HPR 酶标二抗，充分混匀，在37 ℃温箱里温育40 min；取出板，洗板5～6 次拍干，加入TMB显色液50 μL/孔，37 ℃避光温育10 min；加入终止液50 μL/孔，ELISA 读板仪450 nm 波长测定样本和对照的吸光值A450[12]。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔A450≤0.2，两孔间A450差距＜0.05，两个阴性对照孔1.0 ≤A450＜1.6，两孔间A450差距＜0.2。判定标准：按照抑制率（PI）=（阴性对照A450平均值-样品血清A450）/阴性对照A450平均值×100%计算，抑制率≥50%时判为抗体阳性，否则为阴性。

1.4 检测结果分析

比较各地BTV 抗体阳性率，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 地区分布

地区统计结果（表2）显示：在12 个县市均检测到BTV 抗体阳性血清，共检出血清阳性2 960份，总样品抗体阳性率为77.9%（2 960/3 800），推断牛BTV 感染在云南省边境地区普遍存在，感染率较高[11]。各县市样品抗体阳性率有所差异，其中陇川县最高（92.0%），孟连县最低（48.0%），差异存在统计学意义（P＜0.05）；瑞丽市相较于澜沧、西盟、孟连等县市，阳性率较高，差异存在统计学意义（P＜0.05）；勐腊县相较于盈江、富宁、陇川、江城等县市，阳性率较低，差异存在统计学意义（P＜0.05）；孟连县与其他县市比较，差异存在统计学意义（P＜0.05）。西盟、孟连和勐腊等县市的采样场户中，有部分场户未检测到BTV 血清阳性样品，其余县市全部检测到BTV 血清抗体阳性样品。

表2 云南边境地区12 县市牛BTV 血清抗体检测结果统计

2.2 群间分布

2.2.1 不同来源 不同来源牛统计结果（表3）显示：本地牛和入境牛BTV 血清抗体阳性率分别为67.9%和84.8%，差异显著（P＜0.05）。

表3 不同来源牛BTV 血清抗体检测结果统计

2.2.2 不同场户类型 不同场户类型统计结果（表4）显示：养殖场、活畜交易市场和散养户BTV 血清抗体样品阳性率分别为78.4%、77.3%和76.8%，养殖场和活畜交易市场的场户阳性率均为100%，散养户为89.8%，差异不明显（P＞0.05）。

表4 不同场户的BTV 抗体检测结果

2.2.3 不同饲养方式 对不同饲养方式的统计结果（表5）显示：舍饲的BTV 抗体血清阳性率最高（81.4%），系牧饲养（72.2%）次之，半放牧半舍饲（62.5%）最低；舍饲与半放牧半舍饲饲养方式比较，差异存在统计学意义（P＜0.05），但与系牧方式比较，差异不明显（P＞0.05）；半放牧半舍饲与系牧方式比较，差异不明显（P＞ 0.05）。未采集放牧牛样品。

表5 不同饲养方式的BTV 抗体检测结果

2.2.4 不同品种 不同品种牛BTV 血清抗体统计结果（表6）显示：黄牛和水牛BTV 抗体阳性率分别为80.0%和61.4%，存在显著差异（P＜0.05）。

表6 不同品种牛的BTV 抗体检测结果

3 讨论

BT 是通过媒介昆虫传播的虫媒病毒病。1979 年我国在云南省师宗县首次分离到BTV，随后湖北（1983）、山西（1993）等地也报道发现BTV[13]。截至2017 年，我国已有11 个省份的63个市（区）检测到BTV 抗体阳性[14-15]。到目前为止，该病无有效治疗措施。近年来BTV 新血清型不断出现，这将会对我国牛羊产业健康发展与畜产品国际贸易造成极大影响，因此开展BTV 血清学流行调查极为重要。

虫媒病毒病的流行主要取决于媒介昆虫的活动情况，易受温度、湿度等因素影响，具有明显地域性和季节性。本次调查的12 个边境县市与老挝、越南、缅甸接壤，处于亚热带、热带地区，年平均气温较高，降雨量较多，适于各类蠓蚊等媒介昆虫的生长繁殖，易于BTV 传播，具有地域代表性。此次检测在12 个边境县市均检测到BTV 抗体阳性血清，且样品抗体总阳性率达77.9%，场户阳性率为93.3%，说明云南边境地区存在一定的BTV 流行风险。12 个县市BTV 抗体阳性率存在差异，可能与采集血液样品的时间、样本数量及场户等差异有关。12 个县市的采样场户中，仅有西盟、孟连和勐腊县的部分场户未检测到BTV血清阳性样品，其余9 个县市采样场户中全部检测到BTV 血清抗体阳性样品，推断BTV 已在该地区定殖，因此需要持续开展BTV 流行病学调查和监测。

本次调查发现，入境牛血清样品抗体阳性率显著高于本地牛（P＜0.05），说明境外地区的BTV 流行可能更为严重，对我国本地牛群威胁较大。本次调查的结果虽然与2019 年的检测结果[11]存在差异，但本次样品检测数量较多，可能更能反映来源地的流行情况。针对境外牛感染较为严重的情况，应该加强海关检疫及运输检疫，并在邻近地带，避免在媒介昆虫活跃的时间内放牧，加强防虫、杀虫措施的实施，减少媒介昆虫对易感动物的侵袭。本次调查中，本地牛采样数量相对较少，后续需要加大样本数量，进一步验证本地牛的BTV流行情况。

在散养户牛血清样品中检测到BTV 阳性抗体的户数相对较少，这可能与牛的饲养方式有关，大部分散养户采取半放牧半舍饲方式。调查发现，舍饲方式下BTV 血清抗体阳性率较高，而半放牧半舍饲方式下BTV 抗体阳性率则较低，可能是由于半放牧半舍饲方式可以保证牛群运动充足，体质更为健壮，对病毒抵抗力较强，感染相对较低。

本研究对不同品种牛的BTV 血清进行抗体检测发现，黄牛较水牛BTV 抗体阳性率高。由于水牛的样本量相对较少，仅能反应出本次检测的情况，牛品种与BTV 血清学阳性情况之间的相关性需要进一步加大样本量来验证。本次采样根据所在地区的实际养殖场户及场户的存栏量按比例随机采集，并未进行科学的采样设计，检测结果具有一定的局限性。后续在进一步开展BTV 流行病学调查时，应科学设计样本采集的标准。

4 结论

通过对云南省12 个边境地区进行牛BT 血清学调查，推断BT 在云南边境地区可能广泛流行，需要引起动物防疫部门和养殖户的重视，应持续开展血清学调查和监测，加强对该病的防控。