白藜芦醇后处理对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障和ICAM-1、VCAM-1 的影响

张晋霞，张志勇，张 蕊，刘 斌，费云瀚，毛文静，邓春颖，李世英

（华北理工大学附属医院，唐山 063000）

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血引起的脑细胞损伤，再灌注后血液再通，而脑损伤程度却进一步加重。血脑屏障（BBB）作为中枢神经系统的细胞与血液中的细胞交换的场所，在调节血脑之间的运输和维持中枢神经系统的稳态起着重要作用。在脑缺血等病理条件下，血脑屏障被破坏，血液中的有毒物质通过受损的血脑屏障渗透到脑实质，损害了正常的脑功能。在缺血后几h 内促炎因子被激活并释放［1］，内皮细胞被炎性因子激活，粘附分子表达增多，包括ICAM-1、VCAM-1 等，促进了白细胞和血小板的移动和粘附。白藜芦醇（Res）是一种植物多酚，具有抗炎、抗肿瘤、保护心脏、抗氧化和保护神经等作用［2］。研究表明［3］白藜芦醇可减轻脑缺血大鼠BBB 通透性，减轻脑损伤。但是，白藜芦醇后处理对脑I/R 大鼠脑水肿、BBB 的通透性、超微结构及ICAM-1，VCAM-1 的影响未见相关报道。本研究探讨不同剂量白藜芦醇后处理对I/R 大鼠血脑屏障及ICAM-1、VCAM-1 的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料 SPF 级健康雄性SD 大鼠105 只（北京华阜康公司），鼠龄8～10 周，体重250～300g。经我院动物伦理委员会批准。白藜芦醇购自Sigma 公司，ICAM-1、VCAM-1 试剂盒购自上海江莱生物公司。

1.2 建立大鼠MCAO 模型 参照改良的Longa 法，10%水合氯醛350mg/kg 麻醉，大鼠备皮、消毒，切开颈部正中皮肤，分离组织。找到右侧颈外A，结扎其远端。动脉夹夹闭右侧颈内A、颈总A。在右侧颈外A 刺破一小口，将MCAO 栓线从颈外A 插入，松开颈内A 动脉夹，将MCAO 栓线插入颈内A，深度为18.5±0.5mm，待有阻力感后停止，2h 后将栓线拔出约10mm。

1.3 分组与给药 随机将大鼠分为：假手术组、I/R 组、Res 组：低剂量（10mg/kg/d）、中剂量（20mg/kg/d）、高剂量（40mg/kg/d），每组21 只。假手术组只分离血管，不结扎血管；其他组均建立MCAO 模型。白藜芦醇组在2h 栓线拔出即刻给予腹腔注射Res，假手术组腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 观察指标 （1）I/R 后23h，尾静脉注入2%伊文思蓝。将脑组织放入3mL 的甲酰胺中，60℃孵育48h，取上清，测630nm 处吸光度值。采用标准曲线，计算伊文思蓝含量。（2）将大鼠断头取脑，称重（为脑组织湿重），放入105℃烘箱烘干48h 后称重（脑组织干重），含水率（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。（3）将脑组织固定2.5%戊二醛 2h，PBS 漂洗后用1%四氧化锇固定1h，梯度酒精脱水，环氧树脂812 浸透后包埋，制成70nm 的切片，电镜观察。（4）按照试剂盒检测脑组织ICAM-1、VCAM-1。

1.5 统计方法 釆用SPSS 软件包进行分析。计量资料用均数±标准差表示，多组间比较釆用单因素方差分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为学评分对比 I/R 后1d，假手术组评分为0.00±0.00 分，I/R 组为2.58±0.37 分，不同浓度Res 组为：2.33±0.71、2.06±0.69、1.88±0.49 分，高剂量组与I/R 组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分、梗死侧脑组织的含水量、脑组织依文思蓝含量结果

2.2 干湿重法对比 I/R 后1d，假手术组脑组织含水量为（74.23±4.36）%，I/R 组为（82.97±4.47）%，不同浓度Res 组为：（80.76±5.82）%，（79.06±5.23）%，（77.65±4.02）%。I/R 组大鼠脑组织含水量高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）。Res 组脑组织含水量均高于假手术组，低于I/R 组，高剂量组Res 脑组织含水量与I/R 组比较差异有统计学意义（P<0.05），结果见表1。

2.3 依文思蓝含量结果 I/R 后1d，假手术组依文思蓝含量为0.96±0.33，I/R 组为6.51±1.21，不同浓度Res组为：6.32±1.36，6.19±1.17，5.96±0.92，I/R 组高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01）。不同浓度Res 组依文思蓝含量低于I/R 组，高剂量组与I/R 组比较差异有统计学意义（P<0.05），结果见表1。

2.4 电镜观察BBB 超微结构 假手术组：血脑屏障结构完整，血管结构正常，无肿胀、变形，内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞结构正常，未发现有细胞水肿或者空泡形成，基底膜与内皮细胞之间连接紧密。I/R 组：血管周边可见水肿，内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞水肿非常明显，周边可见大片状水肿及坏死，基底膜与内皮细胞的连接出现大片状断裂。细胞器如线粒体、核糖体、内质网等出现溶解或破坏。不同剂量Res 组：BBB损坏程度较I/R 组轻，内皮细胞与基底膜连接较紧密，周细胞、星形细胞、内皮细胞、基底膜等结构较完整，破坏程度较轻。神经细胞核、胞浆异常结构改善，以高剂量组更为明显（图1）。

图1 各组大鼠血脑屏障超微结构

2.5 脑组织ICAM-1、VCAM-1 结果 I/R 后1d，I/R组脑组织中ICAM-1、VCAM-1 的含量高于假手术组，Res 组脑组织中ICAM-1、VCAM-1 的含量低于I/R 组，高剂量组与I/R 组ICAM-1、VCAM-1 的含量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠梗死侧脑组织ICAM-1、VCAM-1结果（pg/ml）

3 讨论

卒中是导致人类死亡的第二大病因，缺血性卒中占绝大多数（85%）。几十年来，人们对I/R 进行了大量的研究，但其机制尚未完全阐明，涉及多种病理过程，包括自由基的大量生成、氧化应激的发生、炎症级联反应、Ca2+超载、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性等［4］。I/R对脑造成多种损害，如活性氧爆发、炎症介质过量产生、白细胞浸润、微血管通透性增高、血脑屏障破坏、毛细血管灌注不足等［5］。

研究报道白藜芦醇在大鼠脑组织缺血后具有保护作用［6］，可能与 AMPK/自噬途径的激活有关。Hou等［7］研究表明白藜芦醇的神经保护作用可能是通过激活JAK2/STAT3 间接上调 PI3K/AKT/mTOR 通路来实现的。本研究中，我们观察了不同剂量Res 后处理对脑缺血再灌注大鼠神经功能的影响，结果显示不同剂量Res后处理均改善了I/R 大鼠的神经功能，证明Res 后处理对I/R 损伤具有保护作用，以高剂量组最为显著。

血脑屏障（BBB）通过维持微环境的稳定性，保证脑功能的正常进行［8］。脑缺血后BBB 的破坏导致脑组织内环境发生了变化，并伴有炎症反应、氧化应激等，引起脑水肿，导致神经元功能障碍。I/R 对BBB 的结构造成了破坏，增加了BBB 的通透性［9］。本研究采用EB法、干湿重法、电镜观察白藜芦醇后处理对BBB 的影响。结果表明，白藜芦醇可减轻脑水肿，减少EB 外渗，改善超微结构的破坏。白藜芦醇可减轻大鼠脑缺血再灌注引起的血脑屏障的破坏。

ICAM-1、VCAM-1 属于内皮粘附蛋白，在静止状态下表达较低。当发生再灌注损伤时，ICAM-1、VCAM-1 通过调节白细胞和血管内皮细胞之间的相互作用，促进白细胞浸润到受损脑区［10］，引起微血管系统紊乱，导致“无血流”现象。研究表明［11］ICAM-1是卒中后脑损伤的重要因素，脑缺血后颅内ICAM-1水平显著增加，ICAM-1 敲除小鼠在脑缺血后表现出白细胞粘附减少、脑梗死面积减少、脑血流改善和死亡率降低［12］。本研究也显示脑缺血再灌注后脑组织中ICAM-1 水平增加，白藜芦醇组干预后ICAM-1、VCAM-1 水平较模型组下降，提示白藜芦醇可以下调ICAM-1、VCAM-1 的表达。本研究也存在一定的不足，没有进行细胞学分析，机制分析不深入，将在后续研究中进行探讨。

综上所述，白藜芦醇可能通过下调ICAM-1 和VCAM-1，改善大鼠BBB 通透性，改善BBB 超微结构的破坏程度，从而减轻I/R 后脑水肿程度，且具有剂量依赖性。