纳豆枯草芽孢杆菌对老陈醋中阿魏酸的影响

董红兵,蔡凯,黄程,龚元元,汪超,祁勇刚,张亮子*

(1.武汉商学院 食品科技学院，武汉 430056；2.湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068；3.武汉一元堂生物科技股份有限公司，武汉 430223)

阿魏酸(ferulic acid)，简称FA，其化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是一种酚酸，它常存在于植物细胞壁中，如当归、川穹、蒲公英、小麦麸皮、玉米皮等，与木质素、多糖交联形成复杂化合物，其具有良好的耐热、耐酸性，对光敏感，见光易分解转化为其他物质。阿魏酸具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抑菌消炎、预防癌症和抗突变等多种作用[1-8]。刘丽萍[9]采用1%的氢氧化钠溶液分别提取了玉米面和玉米皮中的阿魏酸，并用HPLC进行了分离测定，发现其阿魏酸含量分别约为1%和4%～5%；欧仕益等[10]采用0.5%的氢氧化钠溶液能快速使麦麸中大部分阿魏酸游离出来；Faulds C B等[11]选用木聚糖酶和阿魏酸酯酶协同酶解小麦麸皮，发现可以有效打破细胞壁多糖结构，显著提高阿魏酸的提取效率；Hoa T T等[12]选用超声波辅助碱解法提取谷糠中阿魏酸取得较佳效果；Sun等[13]采用超声波溶剂法提取了川穹中的阿魏酸，发现以乙醇为溶剂，超声波提取效率显著优于碱提法；Grabber J H等[14]采用组织培养获得了较高含量的阿魏酸衍生物。

老陈醋，是以高粱为主要原料，以谷糠和麸皮为辅料，大曲为糖化发酵剂，经糖化酒精发酵、醋酸发酵，再经熏醅、陈酿等工艺酿造而成的传统固态食醋，老陈醋工艺也在我国北方其他地方被推广，而根据地方谷物资源，原料可选用玉米、小米、麸皮、大米等来酿造。对老陈醋中有机酸的研究较多，而很少涉及阿魏酸，弓晓艳[15]以山西老陈醋为研究对象，探究了老陈醋的微生物群落结构动态变化，发现包括乳酸菌、醋酸菌、各种芽孢杆菌等优势细菌；苏静[16]研究了老陈醋中多酚类物质及其抗氧化活性；王元太等[17]研究了老陈醋中除了乙酸和乳酸外α-酮戊二酸、苹果酸及琥珀酸含量较高，特别是琥珀酸高达0.787 mg/mL，正是由于多种不挥发酸的协同作用才使山西老陈醋的酸味醇厚绵长、柔和可口；刘凯凤等[18]从老陈醋中分离3种产酸菌，包括巴氏醋杆菌、短乳杆菌、枯草芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌能产生乙酸和琥珀酸，还产生了乙偶姻和3种吡嗪类物质。

有学者对食醋中阿魏酸的菌种、转化、功能进行了研究[19-24]，代谢产生阿魏酸的一般为烟曲霉、黑曲霉。实验在纳豆发酵过程中发现纳豆枯草芽孢杆菌具有代谢产生阿魏酸的酶系，因此将其用于老陈醋中，研究其对老陈醋原料玉米、麸皮和谷糠等的酶解作用，以期提升老陈醋中阿魏酸的含量，为工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米、麸皮、谷糠、大曲、特级老陈醋：由湖北建始天龙实业有限公司提供。

氯化钠、蛋白胨、酵母膏、无水乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙酸：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

纳豆枯草芽孢杆菌(菌种编号：WBUSPN02)：实验室保藏菌种。

液体培养基：1% NaCl、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、100 mL去离子水，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器设备

PC-420磁力恒温搅拌器 美国Corning公司；HRN32手持折射仪 德国托摩根公司；SW-CJ-2D净化工作台 广州瑞智科学仪器有限公司；LHS-250SC型智能恒温恒湿箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SLY-2112B型大型立式双层大容量恒温培养摇床 金坛市盛蓝仪器制造有限公司；YM系列A型立式压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；QDWZⅠ3000-7D湿法粉碎机 无锡轻大食品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 老陈醋工艺流程

1.3.2 操作要点

取5 kg玉米，粉碎至通过100目筛的质量比为1∶1；取3.2 kg大曲，粉碎至能通过200目筛。

润水蒸熟后的高粱，混合大曲，搅拌均匀，入缸，20 ℃保温4 h，进入糖化和酒精发酵，每天搅拌1次，发酵5 d至酒精度不再上升，封缸发酵10 d。

取谷壳12 kg谷糠和6 kg麸皮，与上述制备的酒醪混合均匀，敞口放置6 h，接种0.5 kg醋化醅，开始醋酸发酵，每天翻拌1次，至第8天时总酸不再升高，加食盐封醅。

1.3.3 不同发酵阶段添加纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸含量的影响

在老陈醋糖化和酒精发酵、封缸发酵、醋酸发酵过程中都有微生物的作用，利用微生物代谢酶系和自身代谢机制，将原料的各种成分代谢为葡萄糖、乙醇、乙酸、乳酸等营养风味物质，包括阿魏酸的代谢形成。分别在糖化酒精发酵阶段的第1天、第3天，封缸发酵的第1天、第4天，醋酸发酵的第1，3，5，7天时加入玉米和大曲总质量6.0%的纳豆枯草芽孢杆菌，取醋酸发酵结束时，测定醋醅的阿魏酸和总酸含量，以不接种纳豆枯草芽孢杆菌作对照，每组做3个平行实验。

1.3.4 菌种不同接种量对阿魏酸含量的影响

在传统老陈醋酿造过程中分离得到多种芽孢杆菌，而这些芽孢菌是食醋风味形成的重要菌群，接种强化菌剂可能会对老陈醋发酵菌群产生影响，自然会影响阿魏酸的代谢。根据1.3.3中阿魏酸含量的结果确定接种时间，纳豆枯草芽孢杆菌接种量分别设置为0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%和8.0%，醋酸发酵结束时，测定醋醅的阿魏酸和总酸含量，每组做3个平行实验。

1.3.5 玉米接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

取玉米50 g，粉碎至通过200目筛，加水200 g，115 ℃灭菌20 min，接种玉米浆液6.0%(V/m)的纳豆枯草芽孢杆菌种子液，置于转速100 r/min、36 ℃的摇床上发酵培养72 h，分别取发酵0，6，12，18，24，30，36 h的发酵液，测定阿魏酸的含量，做4个平行实验。

1.3.6 麸皮接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

取麸皮50 g，粉碎至通过200目筛，加水200 g，115 ℃灭菌20 min，接种麸皮浆液6.0%(V/m)的纳豆枯草芽孢杆菌种子液，置于转速100 r/min、36 ℃的摇床上发酵培养72 h，分别取发酵0，6，12，18，24，30，36 h的发酵液，测定阿魏酸的含量，做4个平行实验。

1.3.7 谷糠接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

取谷糠50 g，粉碎至通过200目筛，加水200 g，115 ℃灭菌20 min，接种谷糠浆液6.0%(V/m)的纳豆枯草芽孢杆菌种子液，置于转速100 r/min、36 ℃的摇床上发酵培养72 h，分别取发酵0，6，12，18，24，30，36 h的发酵液，测定阿魏酸的含量，做4个平行实验。

1.3.8 食醋质量评价

以1.3.4研究的纳豆枯草芽孢杆菌种子液添加时间和添加量按照1.3.1的老陈醋工艺流程制备老陈醋，测定总酸、不挥发酸、可溶性无盐固形物和阿魏酸等理化指标，以不添加纳豆枯草芽孢杆菌制备的老陈醋为对照，对老陈醋进行质量评价。

1.4 指标测定

1.4.1 阿魏酸的测定

参照何粉霞[25]关于阿魏酸的测定方法，并做适当优化。取醋醅，压榨取醋汁，或发酵浆液过滤后，5000 r/min离心，取上清液10 mL，加入6 mL乙酸乙酯萃取，重复3次，取乙酸乙酯层，合并萃取液，旋转蒸干，得到阿魏酸粗品。用4 mL无水乙醇溶解，于286 nm下测定其吸收值，每个样品做3个平行实验。

1.4.2 总酸、不挥发酸、可溶性无盐固形物的测定

参考GB 18187-2000《酿造食醋》中规定的方法测定。

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段添加纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸含量的影响

食醋是一种通过多菌系相互拮抗、多阶段的复杂发酵过程获得的传统发酵调味品，其原料涉及到多种谷物及其加工副产物，营养成分丰富而复杂，基于研究阿魏酸的变化，添加微生物强化菌剂，同时也可能会影响食醋发酵进程，进而影响食醋的感官和理化指标。由于食醋在糖化酒精发酵、封缸发酵、醋酸发酵中都有微生物的代谢活动，因此选择在这些发酵过程中添加纳豆菌，研究其对食醋的影响，见图1。

图1 不同发酵阶段添加纳豆枯草芽孢杆菌对醋汁阿魏酸和总酸含量的影响Fig.1 Effect of inoculating Bacillus subtilis natto in different fermentation stages on ferulic acid and total acid content of vinegar juice

由图1可知，在糖化酒精发酵起始或初期加入纳豆枯草芽孢杆菌，醋汁的阿魏酸含量分别达到了60.16，59.28 mg/L，在醋酸发酵阶段加入，则对阿魏酸含量的提升不如糖化阶段显著，仅为36.59 mg/L，且添加时间越晚，阿魏酸含量越小，但比在封缸发酵阶段添加效果仍明显好。在糖化和醋酸发酵起始时添加，会显著降低醋汁的总酸含量，使总酸下降约1.2 g/dL，严重影响原料利用率，可能是此时添加会影响其他微生物增殖，进而影响食醋发酵进程，因此选择在糖化酒精发酵第3天添加纳豆枯草芽孢杆菌较适宜。

2.2 菌种不同接种量对阿魏酸含量影响

食醋发酵过程是一个霉菌、酵母、细菌等几十种甚至上百种菌株受营养成分和生长条件影响，而此消彼长、相互影响的复杂发酵体系，而纳豆枯草芽孢杆菌是一种好氧菌，繁殖和适应环境能力强，添加至发酵中的菌落数可能会竞争抑制其他菌落的增殖与代谢。

由图2可知，在糖化酒精发酵第3天添加纳豆枯草芽孢杆菌，随着接种量的增大，阿魏酸含量先快速上升至59.36 mg/L，而后增长缓慢趋于稳定，而总酸随着接种量的增大较稳定，但增至5.0%以后显著下降，可能是接种量过大打破了糖化酒精发酵过程的菌群平衡，影响了发酵进程，降低了原料利用率，因此接种量为5.0%时较合适。

图2 纳豆枯草芽孢杆菌不同接种量对醋汁阿魏酸和总酸含量的影响Fig.2 Effect of different inoculation amount of Bacillus subtilis natto on ferulic acid and total acid content in vinegar juice

2.3 玉米接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

玉米作为三大主粮之一，也是酿造食醋的主要原料，刘丽萍以玉米研究对象，探究了玉米中阿魏酸的含量，通过加强碱水解，发现玉米面中含有较高含量的阿魏酸，而玉米麸皮中含量更高，可达5%。

由图3可知，将玉米粉碎，高温蒸煮后接种纳豆枯草芽孢杆菌，阿魏酸随着发酵时间的延长先缓慢增加后显著增加，至24 h时达到3.729 g/L，而后缓慢减小。接种后，菌株快速增殖，代谢分泌酶系酶解玉米营养成分，产生阿魏酸，当阿魏酸增至最高时，可能菌株又分泌酶解阿魏酸的酶，使之又缓慢减少。

图3 玉米接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响Fig.3 Effect of maize inoculated with Bacillus subtilis natto on ferulic acid content

2.4 麸皮接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

麸皮是固态食醋酿造中一种重要的辅料，也是制作大曲的原料，同时其含有较高的淀粉、蛋白质、纤维素等营养成分，也被微生物利用，张欣等综述了含有阿魏酸的主要原料，包括麸皮、玉米、谷壳等。

由图4可知，发酵麸皮浆液的阿魏酸含量与玉米浆液变化趋势一致，但发酵至24 h时，阿魏酸含量仅为1.018 g/L，为玉米浆液的27.29%,显著低于玉米浆液的含量，由于玉米和麸皮的粒径一样小，因此，可以推测麸皮的阿魏酸含量远低于玉米。

图4 麸皮接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

2.5 谷糠接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

谷糠也是固态食醋酿造的重要辅料，其起着疏松醋醅、供给氧气、利于物质和热量交换的作用，对食醋醋酸发酵成败至关重要。谷糠与玉米、麸皮在质地和营养成分上的较大的区别，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，在醋酸发酵时其不高温蒸煮，且整粒使用不粉碎。

图5对比了整粒和粉碎谷糠浆液发酵过程中阿魏酸含量的变化，其中粉碎谷糠浆液的阿魏酸变化趋势与玉米、麸皮浆液一致，发酵24 h时阿魏酸含量最高，达到0.661 g/L，仅为玉米浆液的17.72%，而不粉碎的谷糠在发酵6 h后才检测到且增长缓慢，至36 h时其含量为0.087 g/L，仅为粉碎谷糠发酵24 h的13.16%。对比接种纳豆枯草芽孢杆菌对玉米、麸皮和谷糠中阿魏酸含量的影响，由于醋酸发酵时谷糠不蒸煮、不粉碎，因此，醋汁中阿魏酸的含量主要来源于纳豆枯草芽孢杆菌对玉米、麸皮的酶解产生。

图5 谷糠接种纳豆枯草芽孢杆菌对阿魏酸的影响

2.6 老陈醋质量评价

以玉米为原料，采用老陈醋传统酿造工艺，在糖化酒精发酵第3天添加玉米和大曲总质量5.0%的纳豆枯草芽孢杆菌种子液，酿造老陈醋，黑褐色、体态黏稠、酯香浓郁，总酸为6.16 g/dL，阿魏酸含量为32.45 mg/L，实验制备的老陈醋与不添加纳豆枯草芽孢杆菌酿造的老陈醋、以高粱为原料酿造的特级老陈醋相比，理化指标见表1。

表1 老陈醋理化指标Table 1 The physicochemical indexes of aged vinegar

由表1可知，总酸、不挥发酸、可溶性无盐固形物差异不显著，而添加种子液，阿魏酸含量是对照组的3.7倍，是高粱特级老陈醋的近10倍。添加纳豆枯草芽孢杆菌种子液作为强化菌剂，在不影响老陈醋整体品质的基础上，提高了以玉米为原料的老陈醋阿魏酸的含量，提升了老陈醋功能性，同时提高了原料利用率和产品附加值。

3 结论

将纳豆发酵用菌种纳豆枯草芽孢杆菌用于提高老陈醋中阿魏酸含量。通过实验，发现在糖化酒精发酵开始的第3天添加5.0%的纳豆枯草芽孢杆菌种子液，醋酸发酵结束时醋汁中阿魏酸含量高达59.36 mg/L。而在糖化酒精发酵第1天添加，虽然阿魏酸含量更高，但会竞争性抑制原有菌群的增殖和代谢，使总酸含量显著降低，进而影响原料的转化率；封缸发酵时添加，阿魏酸含量增加不显著，可能是此时封缸发酵为厌氧发酵，纳豆枯草芽孢杆菌不增殖，或菌体直接自溶，在后期醋酸发酵菌落数也较少，效果不佳；醋酸发酵起始时添加，阿魏酸可达36.59 mg/L，添加时间越晚，其含量越小，可能是纳豆枯草芽孢杆菌受到醋酸菌的竞争抑制和高浓度醋酸的胁迫，影响其增殖与代谢。

食醋中的3种原辅料玉米、麸皮和谷糠经粉碎、打浆、115 ℃灭菌后，分别接种纳豆枯草芽孢杆菌，随着发酵时间的延长，阿魏酸含量均是先显著增大而后缓慢减小，均在24 h时达到最大值，分别为3.729，1.018，0.661 g/L，因此，纳豆枯草芽孢杆菌可能是代谢相关酶系降解原料中的阿魏酸酯生成阿魏酸，当阿魏酸酯含量极低时，菌株代谢酶解阿魏酸的酶系，使阿魏酸进一步酶解而含量缓慢减小。谷糠不粉碎时，阿魏酸缓慢增加，至36 h时其含量为0.087 g/L，仅为粉碎谷糠发酵24 h的13.16%，由于食醋酿造时，谷壳不粉碎、不高温加热，因此醋汁中阿魏酸主要来源于玉米和麸皮。

以玉米为原料，采用老陈醋传统酿造工艺，在糖化酒精发酵第3天添加玉米和大曲总质量5.0%的纳豆枯草芽孢杆菌种子液，酿造的老陈醋，酯香浓郁，总酸为6.16 g/dL，阿魏酸含量为32.45 mg/L，其阿魏酸含量是不添加种子液的3.7倍、高粱特级老陈醋的近10倍，添加纳豆枯草芽孢杆菌种子液作为强化菌剂，在不影响老陈醋整体品质的基础上，提高了以玉米为原料的老陈醋的阿魏酸含量，提升了老陈醋的功能性，为工业化生产提供了理论基础。