斑马鱼有氧运动能力评估方法的探究

杨 栋,陈章林,肖姜伶,周作琼,张 平,彭夕洋,郑 澜,汤长发

(湖南师范大学 体育学院,中国湖南 长沙 410081)

斑马鱼具有基因组与人类基因组相似度高、基因编辑简单、饲养方便等特点,而且其水环境适合多种运动方案和高强度运动训练的开展,是一种新兴的研究运动干预效果的理想模型[1]。运动方案的设计需要考虑运动强度、运动频率、运动时间和能量供应方式。研究表明,不同的运动干预方案对斑马鱼机能的影响截然不同,合理的运动方案对实现预期的运动干预效果至关重要[2]。建立斑马鱼有氧运动能力评估方法和有氧/无氧运动训练判断方法,有利于了解斑马鱼能承受的运动强度及运动时能量供应状态,为精确制定斑马鱼运动干预方案奠定基础。

临界游泳速度是鱼类测试方案中达到的最大游泳速度,体现了鱼类在持续的游泳活动中提供能量的最大能力,可作为鱼类游泳能力和代谢性能的评估指标[3]。斑马鱼临界游泳速度易受多环芳烃和2,3,7,8-四氯二苯并二恶英(TCCD)等毒性物质的影响,常被用于水质监控和药物毒性检测[3～4]。在临界游泳速度测试中,鱼类的实时耗氧量与游泳速度呈正相关[5～7],鱼类的最大耗氧量类似于人类的最大摄氧量,反映了鱼类最高代谢率[3],可作为评估有氧运动能力的重要指标[8～9]。目前,已有研究通过Loligo泳道呼吸仪,设计了成年斑马鱼的耗氧量测定方案[5～7],但由于不同年龄斑马鱼的体长、体重和基础代谢速率有差异,以往研究未探讨耗氧量测定方案在不同年龄阶段斑马鱼中测试的可行性,以及耗氧量与游泳速度之间的关系。衡量有氧运动能力的另一个经典指标是血乳酸阈。血液中乳酸浓度随运动强度的增加而增加,当运动强度达到某一负荷时,血乳酸浓度急剧增加的拐点称为乳酸阈,表示机体从有氧运动向无氧运动的转折点[10]。然而,关于斑马鱼血乳酸阈的测定方法目前尚未有报道,其血乳酸水平与运动强度的关系也有待研究。基于此,本文拟探究通过测量最大耗氧量、临界游泳速度、血乳酸阈等指标来综合评估斑马鱼有氧运动能力的方法,以期为建立水生生物有氧运动能力评价指标体系奠定基础。

本研究设计了泳道呼吸仪耗氧量测量方案,该方案适用于测量青年、中年和老年斑马鱼的最大耗氧量;同时,设计了乳酸阈检测方法,实现了不同游泳速度下斑马鱼血乳酸的连续测定,分析了斑马鱼血乳酸水平与运动强度的关系。本文建立的斑马鱼耗氧量和血乳酸阈测定方案,为有效评估斑马鱼有氧运动能力提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器设备

野生型斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心,饲养条件为水温28℃、光照14 h/d,每天投喂丰年虾3次。研究中使用的仪器主要包括丹麦Loligo泳道呼吸仪和德国EKF公司的微量血乳酸检测仪,前者用于测定临界游泳速度(Ucrit)和耗氧量(MO2),后者用于测定血乳酸值。其他材料和试剂包括:斑马鱼采血针(北京市红星区医疗设备厂)、Lactate Scout试纸片(EKF公司,德国)、三卡因麻醉剂(Sigma公司,美国)和肝素钠(5 mg/mL,生工生物工程上海股份有限公司)等。

1.2 斑马鱼临界游泳速度与相对临界游泳速度的测定

1.3 斑马鱼耗氧量测定

1.4 单位距离能耗与最优游泳速度的计算

单位距离能耗(cost of transport,COT)表示维持标准代谢率、克服阻力并以特定水速加速的能量消耗,可用于确定斑马鱼运动单位距离所需的能量。参照Palstra等[11]鱼类COT模型:COT=实时耗氧量/实时游泳速度。根据COT与递增速度节点做图,经回归分析推导COT与速度节点的方程[11]。依据Palstra等[12]定义的最优游泳速度(optimal swimming speed,Uopt):每单位距离游泳时最低的耗氧量或最低COT所对应的速度,可推算出Uopt是COT方程的一阶导数等于零时所对应的速度。

1.5 斑马鱼血乳酸阈测定

以斑马鱼临界游泳速度的0%、20%、40%、60%、80%、100%设置梯度游泳运动强度节点,在每个运动强度节点运动5 min。使用微量采血针进行尾静脉取血,并使用微量血乳酸检测仪测量血乳酸,绘制不同运动强度节点的斑马鱼血乳酸值曲线图,从而求得斑马鱼的血乳酸阈。

1.6 统计学分析

所有数据用平均值±标准差(x±s)表示。数据分析采用SPSS 23.0进行独立样本T检验,显著性水平为P＜0.05。采用Graphpad Prism 9.1.0制图。

2 结果

2.1 不同月龄斑马鱼的最大耗氧量

斑马鱼的最大耗氧量(MO2max)随着年龄的增长呈现下降的趋势(图1),3月龄斑马鱼的MO2max高于8月龄(P＜0.05)和14月龄斑马鱼(P＜0.01);8月龄斑马鱼的MO2max较14月龄斑马鱼高,且差异具有显著性(P＜0.05)。

图1 3、8和14月龄斑马鱼的最大耗氧量Fig.1 Maximum oxygen consumption(MO2max)of 3-,8-,and 14-month-old zebrafish*:P＜0.05;**:P＜0.01.

2.2 不同月龄斑马鱼的相对临界游泳速度

检测结果显示,3月龄、8月龄和14月龄斑马鱼的 Ucrit-r分别是(13.84±0.73)BL/s、(14.05±0.35)BL/s和(11.49±0.42)BL/s(图 2)。其中,3 月龄和 8月龄斑马鱼的Ucrit-r无显著差异,3月龄和8月龄斑马鱼的Ucrit-r显著高于14月龄斑马鱼的Ucrit-r(P＜0.01,P＜0.05),表明随着年龄的增长,8月龄之后斑马鱼的运动能力下降显著。

图2 3、8和14月龄斑马鱼的相对临界游泳速度Fig.2 Relative critical swimming speed(Ucrit-r)of 3-,8-,and 14-month-old zebrafish*:P＜0.05;**:P＜0.01.

2.3 不同月龄斑马鱼的耗氧量、单位距离能耗和最优游泳速度

图3 3月龄斑马鱼耗氧量(A)和单位距离能耗(B)(n=8)Fig.3 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 3-month-old zebrafish(n=8)

图4 8月龄斑马鱼耗氧量(A)和单位距离能耗(B)(n=7)Fig.4 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 8-month-old zebrafish(n=7)

图5 14月龄斑马鱼耗氧量(A)和单位距离能耗(B)(n=3)Fig.5 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 14-month-old zebrafish(n=3)

2.4 不同月龄斑马鱼的血乳酸阈

不同月龄斑马鱼的血乳酸检测结果显示,随着运动强度的增加,血乳酸浓度呈现上升趋势。在低强度运动中,斑马鱼的血乳酸浓度基本保持平稳或呈现缓慢上升的趋势。3月龄斑马鱼的血乳酸浓度随着运动强度的增加,在60%的Ucrit运动强度后急剧上升,其血乳酸阈为(2.98±0.86)mmol/L。8月龄斑马鱼和14月龄斑马鱼的血乳酸浓度在80% Ucrit运动强度后急剧上升,血乳酸阈分别为(2.47±0.29)mmol/L 和(3.83±0.25)mmol/L(图 6)。在相同的Ucrit百分比下,14月龄斑马鱼的血乳酸阈值高于8月龄斑马鱼。

图6 3、8和14月龄斑马鱼血乳酸在不同训练速度下的变化Fig.6 Blood lactic acid change of 3-,8-,and 14-monthold zebrafish under different training speeds

3 讨论

有氧运动能力是评估斑马鱼机能状态的指标,作为监控手段被广泛应用于运动医学[13～14]、环境监测[3,15]、遗传[16]和药理[17～19]等领域的研究。本文建立了基于最大耗氧量和血乳酸阈评估斑马鱼有氧运动能力的方法。针对3月龄、8月龄和14月龄斑马鱼有氧运动能力的检测数据说明,该方法体系对各年龄阶段斑马鱼具有可行性,为涉及有氧运动能力检测的斑马鱼模型应用研究奠定了方法学基础。

评估有氧运动能力是合理设计斑马鱼运动方案的重要前提。运动方案中设计的运动强度过大,将会导致斑马鱼病理性心肌肥大[20]、免疫力降低、代谢重编程[21],促进炎症的发生[22],影响运动干预效果的判断。Palstra等[11]最早对3月龄斑马鱼在不同游泳速度下的耗氧情况进行了研究。斑马鱼的有氧运动能力与其年龄及体质差异密切相关,我们发现Palstra制定的测定方案不适合中、老年斑马鱼的运动耗氧量测定,对不同年龄斑马鱼的有氧运动能力测定有局限性。因此,在借鉴国外耗氧量测定方法的基础上,本研究针对不同年龄阶段斑马鱼的体质特征对测试方案进行了优化,经过大量前期试验,最终确定了本实验检测斑马鱼耗氧量的方法。本实验确定的检测斑马鱼耗氧量的方法可适应于不同年龄段的斑马鱼耗氧量测试,结果曲线基本符合国外关于斑马鱼耗氧量的测试结果。通过测定3月龄、8月龄和14月龄斑马鱼的有氧运动能力,经回归分析,我们推导出3月龄、8月龄和14月龄斑马鱼的MO2及COT方程,并获得这3种年龄阶段斑马鱼的Uopt,验证了耗氧量测定方法的科学性和可行性。

乳酸阈是界定机体在运动过程中,由中强度的有氧运动为主向高强度无氧运动为主的过渡点,被广泛应用于人类有氧能力的评估。与简单、易行的人类血乳酸检测不同,斑马鱼由于血管小、血量少、取血难,递增运动不同节点下血乳酸的检测是关键技术难题。目前,国内外关于利用血乳酸检测斑马鱼有氧运动能力及血乳酸水平与运动强度关系的研究尚属空白。本研究利用微量采血针采集斑马鱼尾部静脉血液,按照斑马鱼血乳酸检测方法,测定血乳酸的水平,首次绘制了斑马鱼的运动血乳酸曲线,发现3月龄斑马鱼的血乳酸阈出现在临界游泳速度的60%左右,而8月龄和14月龄斑马鱼的血乳酸阈在临界游泳速度的80%左右出现。从结果上看,3月龄斑马鱼的有氧运动能力可能要比8月龄和14月龄斑马鱼的有氧运动能力差,但实际而言,3月龄、8月龄和14月龄斑马鱼在60% Ucrit所对应的实际速度是不一样的,所以本文没有对不同年龄段斑马鱼血乳酸阈的变化趋势进行分析,只是探讨3月龄、8月龄和14月龄斑马鱼的血乳酸阈拐点出现的速度占Ucrit的百分比,为斑马鱼有氧和无氧运动干预方案的界定与制定提供参考。

综上所述,本研究确定的最大耗氧量和血乳酸阈的测试方法,可有效评估斑马鱼有氧运动能力和最佳游泳速度,为斑马鱼模型在运动医学、环境监测、遗传和药理等领域中的应用提供了有氧运动能力的精准评估手段。