崔妍春,张化贤,王爱辉,薛勇*
(1.中国海洋大学 食品科学与工程学院,山东 青岛 266003;2.青岛渤海农业发展有限公司,山东 青岛 266000)
我国贝类资源丰富,养殖总产量占我国海洋水产品的50%左右,在渔业经济中有十分重要的地位,是重要的海洋水产资源[1]。贝类蒸煮液是贝类加工成冷冻产品或干制品过程中产生的副产物,富含可溶性蛋白质、糖类等营养物质以及丰富的滋味、气味物质,是制备海鲜调味基料的优质原料[2]。我国贝类产品加工方式主要采取传统的蒸煮方法,因此导致大量贝类蒸煮液流失,造成了极大浪费,且给企业污水处理增加了成本。目前对贝类蒸煮液的利用率低,受限于滋味等方面的差异及特点,仅有牡蛎相关制品较为成熟。因此,如何有效利用贝类蒸煮液,弥补滋味不足,减少资源浪费是贝类加工企业亟待解决的问题。
滋味成分是指水溶性的、低相对分子质量的非挥发性化合物。目前,有关贝类产品滋味成分的研究显示,贝类中重要的滋味成分有游离氨基酸、核苷酸及其衍生物、无机盐和季铵碱等,这些物质往往相互协同作用[3],赋予贝类鲜味及咸味等味道。此外,大部分滋味物质还是挥发性风味物质的前体,对食品的特征风味起到了重要作用[4]。因此,滋味成分的检测是评价贝类基本风味的一个重要指标,也是产品品质的重要体现。
本研究对菲律宾帘蛤(Ruditapesphilippinarum,蛤蜊)、蓝蛤(Aloididaealoidis)、近江牡蛎(Ostrearivularis)蒸煮液的主要滋味物质进行定量分析,结合感官评价实验,系统研究了3种蒸煮液的滋味成分组成差异,在分子水平上分析滋味缺失原因,为贝类蒸煮液的滋味优化及贝类资源的进一步利用提供了理论基础,对贝类调味品的开发及精深加工具有重要意义。
近江牡蛎:海臻源生态产业公司;蓝蛤:购于日照市岚山淦盛海产品加工厂;蛤蜊:购于青岛市市南区市场。样品购买后于-20 ℃冰箱中贮藏备用。
色谱纯甜菜碱、胆碱标准品、葡萄糖标准品:购于国药集团化学试剂有限公司;二水合氧化三甲胺(纯度>99%):购于北京中生瑞泰科技有限公司;色谱纯乙醇、甲醇、乙腈:购于美国默克股份有限公司;色谱纯5′-鸟苷酸(GMP)、5′-肌苷酸(IMP)、5′-二磷酸腺苷(ADP)、5′-腺苷酸(AMP)、肌苷(HxR)、次黄嘌呤(Hx)标准品:购于北京索莱宝科技有限公司;酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸标准品:购于北京曼哈格生物科技有限公司;琥珀酸标准品:购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;其他试剂均为国产分析纯试剂。
TG-16WS型台式高速冷冻离心机、L-8900型全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司;Starter 3100型pH计 美国Ohaus公司;1100型液相色谱仪、Agilent 1260型高效液相色谱仪、液相色谱-三重四级杆质谱联用仪 美国Agilent公司;AA-68007型原子吸收分光光度计 日本Shimadzu公司;7200型可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司。
1.3.1 贝类提取液的制备
取蛤蜊、蓝蛤、近江牡蛎于室温下解冻、清洗,按1∶2的比例加入蒸馏水,蒸煮20~30 min,蒸煮过程中保持微沸状态,蒸煮液于4 ℃、4000 r/min离心10 min,得到上清液。样品分别标记为HG(蛤蜊蒸煮液)、LG(蓝蛤蒸煮液)、ML(牡蛎蒸煮液)。
1.3.2 游离氨基酸含量的测定
准确称取1 mL样品,加入5 mL、20%的三氯乙酸溶液,混匀后以三氯乙酸定容至25 mL,用双层滤纸过滤后取上清液。将上清液于4 ℃、10000 r/min离心20 min,取离心上清液过0.22 μm水膜,采用氨基酸自动分析仪测定。
1.3.3 核苷酸及其关联化合物含量的测定
采用高效液相色谱法(HPLC)测定核苷酸及其关联化合物的含量。色谱条件:色谱柱Capcell Pak C18 SG120(4.6 mm×150 mm, 3 μm);流动相:20 mmol/L乙酸+20 mmol/L柠檬酸+40 mmol/L三乙胺,用氢氧化钾将pH调至4.8,0.22 μm过膜;紫外检测波长260 nm;柱温40 ℃;等度洗脱;流速0.8 mL/min;进样量10 μL。
1.3.4 有机酸含量的测定
采用高效液相色谱法(HPLC)测定有机酸含量。色谱条件:色谱柱Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm, 3 μm);流动相:0.05 mol/L磷酸二氢钠,用磷酸将pH调至3,0.22 μm过膜;紫外检测波长210 nm;柱温25 ℃;等度洗脱;流速1 mL/min;进样量20 μL。
1.3.5 还原糖含量的测定
还原糖含量采用还原糖试剂盒(50T/24S,北京索莱宝科技有限公司)测定。
1.3.6 无机离子含量的测定
Na+、K+含量的测定采用原子吸收光谱法,参照GB 5009.91-2017;PO43-含量的测定采用钼蓝比色法,参照GB 5009.87-2016;Cl-含量的测定采用硝酸银滴定法,参照GB 5009.44-2016。
1.3.7 谷胱甘肽含量的测定
谷胱甘肽含量通过微量A006-2-1还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。
1.3.8 季胺化合物的测定
采用高效液相色谱-串联质谱法测定季胺化合物的含量。色谱条件:色谱柱Waters Atlantis HILIC Silica(2.1 mm×150 mm,5 μm);柱温25 ℃;流速0.25 mL/min;流动相A:10 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸,流动相B:乙腈+0.1%甲酸;质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子检测模式,多反应监测(MRM)模式,干燥气温度350 ℃,干燥气流速9 L/min,雾化气压力37 psi,毛细管电压3500 V,碎裂电压碰撞能量。定量离子质荷比(m/z):甜菜碱(118.1→58.1)、胆碱(104.1→60.2)、氧化三甲胺(76→58)。
1.3.9 氨基酸与核苷酸的协同增鲜作用分析
采用味精当量[5](equivalent umami concentration, EUC)来评价氨基酸与核苷酸的协同增鲜作用,即其协同作用产生的鲜味强度相当于多少浓度的味精(MSG)所产生的鲜味强度,计算公式如下:
EUC(g MSG/100 g)=∑aibi+1218(∑aibi)(∑ajbj)。
式中:ai为Glu或Asp的浓度(g/100 g);aj为5′-GMP、5′-IMP或5′-AMP的浓度(g/100 g);bi为Glu或Asp相当于MSG的相对鲜度系数(Glu=1、Asp=0.077);bj为5′-IMP、5′-GMP或5′-AMP相当于MSG的相对鲜度系数(5′-IMP=1,5′-GMP=2.3,5′-AMP=0.18);1218为基于所有浓度的协同作用常数。
1.3.10 滋味活度值(TAV)
TAV值按下列公式计算:
式中:C为滋味物质的浓度;T为滋味物质的滋味阈值。
1.3.11 感官评价
感官评价采用描述性分析(quantitative descriptive analysis,QDA)方法,对样品的酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味以及醇厚感进行评价,采用五点评分法(0表示没有味道,4表示味道最浓烈),事先对小组成员进行基本滋味培训,熟悉样品特性和感官强度,小组包括10名成员,7女3男,年龄均在21~30岁之间。
1.3.12 数据处理与分析
采用Origin 9.0软件对数据进行作图,运用分析软件SPSS 24.0进行统计分析,采用ANOVA算法进行方差分析,采用Tukey's test算法进行多重比较分析,判断显著性差异(P<0.05)。
不同贝类蒸煮液的滋味轮廓差异见图1。
图1 不同贝类样品的滋味轮廓
由图1可知,3种样品的苦味较低,均有较好的可接受度,样品在咸味、鲜味、醇厚感方面差距较大,主要与样品中多肽、游离氨基酸、各呈味物质的含量等密切相关。蛤蜊蒸煮液的整体感官评分最低,滋味较淡,蓝蛤蒸煮液的酸味稍微突出,咸味弱,牡蛎样品的醇厚感、鲜味和咸味均较强,酸味相对较低,综合来看,蓝蛤蒸煮液和蛤蜊蒸煮液有相似的滋味轮廓,以鲜味为主,牡蛎样品的感官评分最高,鲜味浓郁,且具有牡蛎特有的厚味感,整体味感更为丰富。
氨基酸组成及其含量对样品滋味特性及整体风味的形成具有非常重要的影响[6],不同的结构特性使其呈现鲜味、甜味、苦味等类型,从而影响样品的滋味特性、浓厚感和丰富度[7]。3种样品中游离氨基酸含量测定见表1。
表1 不同贝类样品中游离氨基酸的含量
由表1可知,3种不同贝类蒸煮液之间的氨基酸总量有较明显的差异。在3种样品中共测得19种游离氨基酸,总量分别为745.2,1178.29,1003.89 mg/dL,与蛤蜊蒸煮液相比,牡蛎和蓝蛤蒸煮液中的游离氨基酸总量均显著上升。蛤蜊样品中,牛磺酸(Tau)、甘氨酸(Gly)含量较高,其次为谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和色氨酸(Trp);蓝蛤样品中Tau、Gly、Ala、Glu含量均较高;牡蛎样品中Tau含量最高,其次为亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)。总体来看,蓝蛤样品中的多数游离氨基酸含量基本与蛤蜊样品的游离氨基酸含量相近,或略高于蛤蜊样品,可能由于蓝蛤个体较小,氨基酸溶出率高,使样品中氨基酸总量提高。3种样品中Tau含量均较高,最高达到总游离氨基酸含量的35%,这与其他实验报道结果相符,章超桦等[8]对马氏珠母贝的游离氨基酸含量进行分析,结果显示Tau在其中占主要作用,Tau呈现一定的苦味,Gly、Ala对样品的甜味有一定的贡献作用,Glu不仅是呈现鲜味的强滋味氨基酸,而且具有改善贝类整体风味的作用,并与核苷酸类物质产生风味协同作用,提升样品的鲜味。
核苷酸及其关联化合物对海产品的滋味有着重要的贡献,不仅是主要的鲜味成分之一,同时还与氨基酸类成分产生协同作用,显著提升总体风味。水产品中常见的天然呈味核苷酸主要包括肌苷酸(IMP)、鸟苷酸(GMP)和腺苷酸(AMP)。对3种样品的核苷酸及其关联化合物进行测定,结果见表2。
表2 不同贝类样品中核苷酸的含量Table 2 The content of nucleotides in different shellfish samples mg/dL
由表2可知,牡蛎样品(95.95 mg/dL)所含核苷酸及其关联化合物的含量最高,其次为蛤蜊样品(66.70 mg/dL)和蓝蛤样品(42.84 mg/dL)。蛤蜊中AMP的含量极高,是蓝蛤的7~8倍,而ADP和IMP含量两者相近。牡蛎样品中,含量较高的为HxR和IMP,其次为ADP和AMP,其他物质含量较低。这些呈味物质中,IMP是鲜味最强的呈味核苷酸,并且与谷氨酸、丙氨酸等游离氨基酸有风味协同效应,产生特有的鲜味,对风味有很强的贡献作用,AMP通常被认为是贝类中很好的风味增强剂,对其特征滋味有重要贡献,一定程度上有抑制苦味的特性[9],并产生一定的咸味和甜味,总体来说,牡蛎中的呈味核苷酸含量较高,说明牡蛎蒸煮液的核苷酸类物质较丰富,可认为是其味道更鲜美的原因之一。
水产贝类中的呈味核苷酸主要由肌肉中的三磷酸腺苷(ATP)降解产生,其途径主要分为ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx,人们普遍认为贝类和鱼类的降解途径不同,对贝类中ATP的降解途径仍存在争议。初期,样品中ATP的降解速度很快,所以在样品中ATP含量未检测出或者含量极低,随着降解进行,各反应产物不断积累,ATP耗尽后,IMP/AMP降解速度增加,导致Hx和HxR进一步积累。由表2可知,各贝类的降解速度不尽相同,由于牡蛎样品中Hx和HxR的含量相对较高,并检测出了较低含量的AdR,因此可以推断其降解程度较高、速度较快,出现更多的降解末端产物,产生的Hx会产生一定的苦味,一定程度上使贝类的风味变差,降解末端产物的出现也表现出产品的新鲜程度较低等特征。刘云等[10]在长牡蛎和中国蛤蜊中检测到AMP、IMP、GMP 3种呈味核苷酸, 其中长牡蛎IMP的平均含量最高,为7.57 mg/100 g,牡蛎中呈味核苷酸的总量同样较蛤蜊和栉孔扇贝的含量高,与实验结果一致。
有机酸是鱼贝类中重要组成部分,也是重要的呈味物质,常见的有乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸等,主要由肌肉中糖原经过糖酵解产生,也是鲜味和酸味的重要载体,而在贝类中起重要作用的主要是琥珀酸。琥珀酸及其钠盐是贝类特征滋味形成的主要物质之一,它与其他鲜味物质协同作用,有一定的助鲜效果。
用高效液相色谱法测定3种样品中有机酸的含量,3种样品中有机酸的含量见表3。
表3 不同贝类样品中有机酸的含量
由表3可知,3种样品的有机酸总量均在200 mg/dL左右,其中蛤蜊样品的有机酸总含量最高,达到239.46 mg/dL;蓝蛤样品的有机酸含量较低,为182.89 mg/dL,其中琥珀酸含量最高,达到141.21 mg/dL;牡蛎样品中,有机酸种类丰富,其中酒石酸含量较高,达到103.44 mg/dL。在3种样品中的柠檬酸含量在30~40 mg/dL,另外在蛤蜊蒸煮液和牡蛎蒸煮液中均检测到了苹果酸,在先前的研究中,郑惠娜等对马氏珠母贝肉的有机酸检测发现,琥珀酸含量为120 mg/dL[11],乳酸含量较低,为2~3 mg/dL,钱建瑛等[12]研究报道了文蛤中的有机酸含量,其中乳酸的含量很高,是文蛤味道鲜美的物质基础之一,其次为柠檬酸、苹果酸,这种差异性与贝类的种类、生长环境、贮存加工方式都有重要的关系。
水产品本身含有的糖是结构和成分较复杂的多糖,是衡量水产品营养价值的重要指标,如扇贝多糖、鲍鱼多糖等,一般不具有甜味,其在特定条件下水解可得到还原性糖。在糖类中,分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。一般认为还原糖均呈现一定的甜味,除蔗糖外,所有单糖及双糖都是还原糖。通过测定还原糖含量初步判断3种贝类样品中糖类对甜味的贡献度,其具体含量见表4。
表4 不同贝类样品中还原糖的含量
由表4可知,蛤蜊和蓝蛤样品中还原糖含量较少,分别为29.05 mg/dL和31.47 mg/dL;牡蛎样品中还原糖含量较高,达到244.34 mg/dL,其浓度为蛤蜊样品的8倍。因此可以推断,相比蛤蜊和蓝蛤,糖类对牡蛎甜味的贡献度更大。
无机离子是水产品中必不可少的呈味成分,阳离子一般产生咸味,阴离子本身被认为无明显的呈味作用,但对阳离子呈味具有辅助作用。水产中常见的呈味无机离子主要包括Na+、K+、PO43-和Cl-,尤其是Na+和Cl-对鱼贝类产品的滋味有重要贡献。对3种样品中Na+、K+、PO43-和Cl-的含量进行测定,结果见表5。
表5 不同贝类样品中无机离子的含量
由表5可知,蛤蜊和蓝蛤样品中4种无机离子的含量较为相近,Na+含量均为18~19 mg/dL,其中蓝蛤蒸煮液中Cl-含量较其他无机离子含量低;牡蛎样品中K+(34.42 mg/dL)含量最高,其次为PO43-(27.96 mg/dL),Na+含量为19.01 mg/dL。在4种无机离子中,Na+咸味较为强烈,Na+的缺失不仅使咸味降低,还会使甜味、鲜味发生劣化,K+具有咸中带苦的呈味特点,其本身缺失会影响鲜味以及产品整体风味,而Cl-的减缺会使浸出物无味或者味道较淡,PO43-的缺失会使整体味道均稍有下降,因此,相比牡蛎,蛤蜊和蓝蛤样品的味觉感知较差。
呈味肽是指从食物中提取或者由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的、分子量低于5000 Da的寡肽类,包括特征滋味肽和风味前体肽,主要通过蛋白质分解得到。不仅对食品天然滋味特性有影响,而且会在加工过程中与其他物质相互作用,产生更加丰富的滋味效应[13-14]。有研究认为,水产品在酶解后产生低分子量肽,是增强浓厚感、持续感和满口感的重要物质,其中谷胱甘肽(GSH)是第一个被鉴定具有浓厚感活性的肽类成分,并且可延长食品的保质期,增强令人喜爱的口感,使口感后味悠长。
对3种样品进行谷胱甘肽含量测定,测定结果见表6。
表6 不同贝类样品中谷胱甘肽的含量Table 6 The content of glutathione in different shellfish samples mg/dL
由表6可知,蛤蜊和蓝蛤样品的谷胱甘肽含量较少,牡蛎样品中谷胱甘肽含量最高,达到11.05 mg/dL,这可能是蛤蜊样品的滋味较为寡淡、丰富度低的重要原因之一。张苏平等[15]测定4种贝类肌肉中谷胱甘肽含量,其中牡蛎肉中谷胱甘肽含量达到33.37 mg/100 g,文蛤和青蛤肉中谷胱甘肽含量较高,分别为82.53 mg/100 g和103.20 mg/100 g,本实验中谷胱甘肽含量较低还有可能是因为样品加热过程中,GSH会被部分氧化成GSSG,使测得的含量降低。有研究表明,谷胱甘肽还可以与IMP、GMP和谷氨酸钠协同作用,产生强烈的肉味,丰富水产品的滋味特征。
水产品中重要的季胺类化合物主要有甜菜碱、胆碱和氧化三甲胺,它们对水产品的滋味具有重要贡献[16],甜菜碱不仅呈现一定的甜味和鲜味,起到增强厚味的作用,而且具有调节渗透压、促进脂肪代谢等生理调节作用,胆碱具有一定的苦味,在一定程度上影响水产品的整体滋味,氧化三甲胺具有一种特殊的鲜味,也带有淡淡的甜味,同时也是水产品中腥味的主要来源。实验通过液质联用,测定3种样品中季胺类化合物的含量,结果见表7。
表7 不同贝类样品中季胺类化合物的含量Table 7 The content of quaternary amine compounds in different shellfish samples mg/dL
由表7可知,3种样品中甜菜碱含量很高,蛤蜊样品中甜菜碱含量为197.64 mg/dL,胆碱含量很低,为0.68 mg/dL;蓝蛤样品中甜菜碱含量相对较少(16.14 mg/dL),季胺类化合物总量最低,仅有18.22 mg/dL;牡蛎样品中的甜菜碱含量最高,达到231.48 mg/dL,在牡蛎蒸煮液呈味过程中起到重要贡献作用,也是牡蛎具有特殊醇厚感的重要原因,在3种样品中均未检测到氧化三甲胺。可以推测,甜菜碱在3种贝类的呈味过程中发挥着主要作用,尤其对牡蛎滋味的贡献最大。
食品不同滋味成分之间会发生相乘、消杀、变调等相互作用,从而对食品整体滋味产生不同的影响。鲜味是水产品中重要的特征滋味,故使用味精当量(EUC)直观反映游离氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)和呈味核苷酸(GMP、AMP、IMP)之间的鲜味协同作用,结果见表8。
表8 不同贝类样品的味精当量(EUC)Table 8 The equivalent umami concentration (EUC) of different shellfish samples g MSG/100 g
由表8可知,蛤蜊、蓝蛤样品中EUC值相差不大,分别为3.17 g MSG/100 g和3.62 g MSG/100 g,牡蛎样品中的EUC值略高于蛤蜊样品,呈现出更加强烈的鲜味。因此,虽然蛤蜊和牡蛎样品中的核苷酸总量较为接近,但由于核苷酸和氨基酸之间的协同增鲜作用可以大大增强贝类的鲜味,使牡蛎样品具有更加强烈的鲜味。在Yamaguchi和Ninomiya的研究中也发现,由于两种物质之间的协同作用,当IMP和谷氨酸存在于食物系统中时,会出现明显的鲜味[17]。
将各样品中基本滋味物质按味觉性质分成7组,根据各基本滋味物质的含量及其阈值,计算得到各物质的滋味活度值(TAV)[18],通常认为,TAV>1时该物质对呈味有重要影响;0.1 表9 不同贝类样品中各种滋味的滋味活度值(TAV)Table 9 The taste activity value (TAV) of various taste in different shellfish samples 在甜味化合物中,3种样品中甘氨酸和赖氨酸的TAV值较高,即甘氨酸和赖氨酸对样品整体甜味具有主要贡献作用,另外,甘氨酸是贝类中共有的甜味成分,能掩盖苦味等不良风味,与水产食品的适口性密切相关,并且研究显示,在贝类中,相对于糖类,甜味氨基酸对贝类整体甜味滋味的贡献度更强,其中Ala和Gly发挥主要作用,与本实验结果相符。在鲜味化合物中,3种样品中Glu的TAV值均较高,表明Glu对贝类滋味有显著影响,并且IMP对牡蛎蒸煮液的鲜味也起到相当重要的作用,而在蛤蜊和蓝蛤样品中没有明显呈味作用,牡蛎样品中Hx和HxR虽然含量高,但由于其阈值较高,TAV值小于0.1,故对滋味的影响不大。在苦味化合物中,由于苦味物质的阈值较高,使大部分苦味物质对样品滋味的影响较小,仅对牡蛎样品的滋味起到一定的修饰作用,但Lioe等[20]研究发现,当苦味氨基酸含量低于呈味阈值时,可增强其他氨基酸的鲜味和甜味,因此,苦味氨基酸对蛤蜊、蓝蛤及牡蛎样品的鲜味和甜味也具有修饰作用。谷胱甘肽只在牡蛎样品中发挥一定的作用,可能是造成几种样品浓厚感差异的关键原因之一,除此之外,样品中氨基酸、核苷酸含量也会影响样品的浓厚感。 整体来看,蛤蜊样品中关键滋味化合物为Glu、Na+、Cl-、酒石酸;蓝蛤样品中关键滋味化合物为Glu、Na+、Ala、GMP、琥珀酸;牡蛎中关键滋味化合物为Glu、IMP、Na+、酒石酸、甜菜碱,且对整体滋味具有修饰作用的甜味、咸味、苦味、浓厚感类呈味物质种类丰富。 本文主要对蛤蜊蒸煮液、蓝蛤蒸煮液和牡蛎蒸煮液3种样品进行主要滋味成分的测定,结果表明,同种贝类呈味物质具有一定的相似性,鲜味和咸味是3种样品中主要的呈味成分,蛤蜊蒸煮液中关键滋味化合物种类少,IMP、GMP的贡献度低,使其味觉感知度和丰富度较差,而IMP在牡蛎蒸煮液中起重要作用,且样品的EUC值较高,氨基酸与核苷酸之间具有更强的协同增鲜作用。结合感官结果表明,蛤蜊、蓝蛤中谷胱甘肽等浓厚感肽含量低可能是造成样品醇厚口感较差的关键原因之一,另外,其氨基酸、核苷酸、季胺类化合物含量低,也是导致样品整体滋味寡淡的重要原因,因此,在蛤蜊、蓝蛤蒸煮液中添加IMP等核苷酸类物质以及浓厚感肽、甜菜碱等滋味成分可以弥补滋味缺失,构建滋味重组体,实现贝类蒸煮液的滋味优化及贝类资源的进一步利用。3 结论