基于高密度遗传图谱的花生籽仁大小相关性状QTL定位

胡晓辉崔凤高杨伟强侯名语张胜忠王 嵩侯 刚王晶珊苗华荣*陈 静*

(1.山东省花生研究所,山东 青岛 266100;2.河北农业大学生命科学学院,河北 保定 071001;3.安徽省农科院作物研究所,安徽 合肥 230001; 4.铁岭农科院,辽宁 铁岭 112616;5.青岛农业大学农学院,山东 青岛 266109)

籽仁大小是花生产量的重要指标,改良籽仁大小对于提高产量具有重要作用。 近年来已检测到一些控制籽仁大小相关性状的QTL[1-10],但在多环境下稳定表达的QTL 数量有限。 成良强以富川大花生×ICG6375的F2、F3群体,检测到8个籽仁长度相关QTL,位于染色体A05、A07、A10、B01、B08、B09和B10;检测到3个籽仁宽度相关QTL 位于染色体A01、B03、B06 染色体上[1]。 Huang等利用中花10 号×ICG12625 构建的F2:3群体检测到籽仁长相关3个QTL,表型变异解释率为9.86%～10.48%;籽仁宽相关4个QTL,表型变异解释率6.39%～12.20%[2]。李振动利用徐州68-4×远杂9102构建的RIL 群体,两年共检测到12 个籽仁长度相关QTL、20个籽仁宽相关QTL 和15 个籽仁长宽比相关QTL,其中A05、A06 染色体在两年重复检测到控制籽仁长(A05)、籽仁宽(A06)、籽仁长宽比(A05)相关的QTL[3]。 宋延滨利用远杂9102与徐州68-4构建的RIL群体和两张遗传图谱,两图谱中在染色体A09 上检测到籽粒长修改QTL、在染色体A05和A09上检测到籽粒长宽比相关QTL[4]。 Chen等利用富川大花生和ICG6375构建了RIL群体,在A07重复检测到控制籽仁长的QTL、在A10 和B02 重复检测到控制籽仁宽的QTL、在A02、A03和A07重复检测到控制籽仁长宽比的QTL[5]。 Wang等利用ZH16×sd-H1构建的RIL 群体和SLAF 高密度遗传图谱,在B07染色体上重复检测到控制籽仁长和籽仁宽的QTL[6]。 Zhang等利用花育36号×6-13构建的RIL群体和SLAF高密度遗传图谱,分别检测到控制籽仁长、籽仁宽和籽仁长宽比的QTL 10个、5个和8个,在多环境下重复检测到位于A02连锁群上Marker938～Marker893 间控制籽仁长的QTLqSL2和籽仁长宽比的QTLqLW2,表型贡献率为42.43%～83.23%[7]。 Huang等共检测到7个籽仁长相关QTL、8个籽仁宽相关QTL,其中位于连锁群A02和B05检测到控制籽仁长主效稳定QTLqSLA2.2和qSLB5、连锁群A03、A07和B06检测到控制籽仁宽稳定QTLqSWA3、qSWA7.1和qSWB6.2[8]。曾新颖等以中花16和J11杂交的RIL群体为材料,两个环境下检测到18个籽仁长相关QTL、16个籽仁宽相关QTL,18个籽仁长宽比相关QTL,在连锁群A05重复检测到控制籽仁长的QTL和籽仁长宽比的QTL、在B06连锁群上重复检测到控制籽仁长的QTL和籽仁宽的QTL[9]。 Luo等以徐花13号和中花6号杂交的RIL群体为材料,在染色体A05上重复鉴定到籽仁长的主效QTLqPLA05.1,在染色体A07上重复鉴定到籽仁长的主效QTLqPLA07、籽仁宽的主效QTLqPWA07[10]。由此可见,利用不同的材料可能会检测到不同的花生籽仁性状相关的QTL,且遗传效应大小各异,因此利用不同群体挖掘不同环境下稳定表达的QTL非常有必要。

作物重要性状基因位点的高效挖掘依赖于遗传图谱标记的稳定性、分布范围和数量多少。花生野生种和栽培种参考基因组信息的公布[11-14]和高通量测序技术的应用为挖掘花生重要性状基因位点奠定了基础。 SLAF-seq技术是一种基于高通量测序大规模开发SNP 及其分型的新技术,在花生图谱构建和QTL 定位方面得到应用[6-7,15-16]。

本研究利用花育28 号和P76 创建RIL 群体,在不同环境下测定RIL 群体的籽仁大小,借助SLAF-seq技术开发的多态性SNP 以及实验室筛选到的多态SSR,联合分析构建高密度遗传图谱,分析控制花生籽仁大小的QTL,鉴定出遗传稳定、贡献率高的主效QTL,为花生产量性状改良奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用花育28号和P76构建的RIL 群体为试验材料。 花育28 号由山东省花生研究所育成,2008年通过山东省审定,2019年通过国家非主要农作物登记;P76为诱变创制的高油酸品系,RIL群体包含146个株系。

1.2 籽仁大小测定

2018年RIL群体(F2∶14)和亲本种植于山东省花生研究所莱西试验站和山东省农科院东营试验基地,每份材料1行,行长1.50 m,行距0.40 m,常规大田管理。 成熟时按株系收获,晾干后剥壳取饱满籽仁30粒以上,利用万深自动籽仁考种分析仪测定各个RIL 家系和亲本的籽仁长度和宽度,重复3次,并计算各个RIL 家系和亲本籽仁长宽比。 采用SPSS软件进行统计分析。

1.3 高密度遗传连锁图谱的构建

DNA 提取、SSR 分析和SLAF 文库构建参照文献[15],以栽培种Tifrunner基因组为参考。SLAF-seq数据分析和基因分型参照Sun等[17]的方法,利用High Map 软件[18-19]构建高密度遗传图谱。 以2018年东营和2018年莱西调查的RIL群体表型数据,包含籽仁长、籽仁宽和长宽比,利用QTL IciMapping v4.1对籽仁大小相关QTL进行定位分析。 QTL 的命名规则为q+性状+染色体数。

2 结果与分析

2.1 籽仁大小表型性状的变异

不同环境下,花育28号和P76籽仁大小表现有一定差异(表1)。 花育28号籽仁长与宽均大于P76,而籽仁长宽比低于P76。 RIL 群体籽仁大小表现为连续变异,每个性状都表现超亲分离,偏度和峰度绝对值均小于1或接近1,频数分布基本符合正态分布,适合进行QTL分析。

表1 亲本及RIL群体籽仁相关表型性状表现Table 1 Performance of seed size traits in parents and RIL populations

图1 两种环境下花生籽仁长、籽仁宽、籽仁长宽比性状频率分布Fig.1 Frequency distributions of seed length,seed width,and ratio of seed length to width under two environments

2.2 高密度遗传图谱构建

以花育28号/P76组合衍生的146份重组自交家系为作图群体,利用SLAF-seq技术开发多态标签。 花育28号SLAF标签数量426 794,平均深度19.11×;P76的SLAF标签数量433 211,平均深度18.26×;RIL群体SLAF标签数量279 638,平均深度4.88×(表2)。 本文共开发464 453个SLAF,亲本间多态性的有12 737个SLAF,满足aa×bb基因分型的为8 755个,占比1.89%。 对这些标签进行过滤筛选,获得高质量多态性SLAF标签为2 350个,在亲本和后代中平均测序深度大于50×和大于10×。

表2 亲本及RIL的SLAF数量及覆盖深度Table 2 Coverage and number of markers for parents and RIL

利用High Map软件构建了一个包含20个连锁群、上图标记2 411 个(SLAF 标签2 350 个,SSR标记61个)、平均距离为0.76 c M、总图距为1 814.72 c M 的遗传图谱(表3)。 B05连锁群上图标记数最多(330个),标记间平均距离0.33 c M;A10连锁群上图标记数最少(12个),连锁群图距最短(42.62 c M)。 20个连锁群中标记间最大距离为22.81 c M,位于B01连锁群;标记平均间距最低的连锁群为A09,间距0.18 c M,标记平均间距最高的连锁群为B01,间距5.33 c M(表3)。 该图谱可用于重要农艺性状QTL定位。

表3 花生20连锁群信息统计Table 3 Description on characteristics of the 20 linkage groups in peanut

2.3 RIL群体中的QTL定位分析

表4表明,共检测到7个控制籽仁长的QTL,PVE变幅为3.393%～10.958%。 加性效应对表型的累计贡献率为42.227%,加性QTL与环境互作对表型累计贡献率为4.717%。 检测到主效QTL有1个,qSLA 02.2表型贡献率10.958%,加性表型贡献率10.536%,LOD值6.993。 与环境互作对表型贡献率相对较大的QTL为qSLA 07,表明该位点易受环境影响。

表4 籽仁大小相关的QTLTable 4 QTLs identification for seed size

共检测到控制籽仁宽的QTL5个,PVE变幅为2.759%～12.912%。 加性效应对表型累计贡献率为32.496%,加性QTL与环境互作对表型累计贡献率为0.725%(表4)。 检测到主效QTL 有1 个,qSWA02表型贡献率12.912%,加性表型贡献率12.910%,LOD 值11.041。

控制籽仁长宽比的QTL共检测到8个,PVE变幅为3.619%～19.256%。 加性效应对表型的累计贡献率为63.153%,加性QTL与环境互作对表型累计贡献率为9.519%(表4,图2)。 检测到主效QTL有3个,qSLWA02.1、qSLWA02.2和qSLWA02.2,LOD 值13.319～17.554,表型贡献率13.070%～19.256%,加性表型贡献率12.707%～17.709%。 检测到qSLWA09.1和qSLWA09.2与环境互作对表型贡献率的影响相对较大,累计5.653%,表明这两个位点的表达易受环境影响。

图2 多环境联合分析定位籽仁大小相关QTL的分布Fig.2 Distribution of QTLs for seed size by multi-environmental joint analysis

将RIL群体籽仁长、籽仁宽、籽仁长宽比相关QTL 进行区间位置比较,在A02、A05、A07、A08、A09和B09连锁群上2个或2个以上QTL在共定位。 其中在A02 连锁群上9.65～10.48 Mb和95.89～98.65 Mb区间发现2个QTL 区间存在共定位。 A02连锁群上9.65～10.48 Mb区间检测到籽仁长QTLqSLA02.1、籽仁宽QTLqSWA02和籽仁长宽比相关QTLqSLWA02.1,该区间内QTL的LOD值范围为6.817～17.554,表型变异解释率为9.122%～14.427%;A02连锁群上95.89～98.65 Mb区间检测到籽仁长相关QTLqSLA02.2和籽仁长宽比相关QTLqSLWA02.2,该区间内QTL的LOD值范围为6.993～13.319,表型变异解释率为10.958%～13.070%。

3 讨论与结论

作物许多重要性状属数量性状,表型易受环境影响,研究人员于是越来越侧重于挖掘遗传稳定、贡献率高和受环境影响小的QTL,来对某性状进行改良。 花生籽仁大小性状表现为正态分布,为数量性状,因此挖掘多环境下稳定表达的籽仁大小性状主效QTL,对产量改良具有重要的理论和实践价值。

本文利用RIL群体和SLAF-seq技术构建包含2 411个上图标记、总图距1 814.72 c M,标记间平均距离为0.76 c M 的高密度遗传图谱。 多环境联合分析在A02 染色体上Marker10593～Marker97229 区间存在籽仁长宽比相关QTL(qSLWA02.1)、籽仁长相关QTL (qSLA02.1)和籽仁宽相关QTL(qSWA02),在A02染色体上Marker140970～Marker133566 区间存在籽仁长宽比相关QTL(qSLWA02.2)、籽仁长相关QTL(qSLA02.2),且对应的LOD值和表型贡献率都较高,说明控制不同性状的QTL可能受同一QTL或基因调控,也可能是两个独立基因的紧密连锁。

目前,花生籽仁大小性状相关QTL 定位已有相关报道,在A02、A03、A05、A07、A10、B06均重复鉴定到相关QTL。 Chen等在染色体A10上重复鉴定到1个籽仁宽相关QTL[5]。 曾新颖等在染色体A05 上重复鉴定到2 个籽仁长相关QTL和2个籽仁长宽比相关QTL,在染色体B06上重复鉴定到2个籽仁长相关QTL 和2个籽仁宽相关QTL[9]。 Huang等在3个环境下重复检测到籽仁长相关QTLqSLA2.2、籽仁宽相关QTLqSWA3、qSWA7.1 和qSWB6.2。 其中籽仁长主效QTLqSLA2.2在3个环境中能重复检测到,置信区间为连锁群A02上62.0～68.5 cM,物理位置为84.50～89.73 Mb,LOD 值为4.8～9.1,加性效应为0.77～1.12,表型变异解释率为14.60%～25.55%[8]。 Zhang等在四个环境下重复检测到籽仁长相关QTLqSL2和籽仁长宽比相关QTLqLW2,位于A02连锁群,物理位置为92.75～99.81 Mb,表型变异解释率均大于10%[7]。 与已报道的QTL 进行比对,本研究在A02连锁群物理位置95.89～98.65 Mb区段检测到控制籽仁长的QTLqSLA02.2和籽仁长宽比的QTLqSLWA02.2,这可能与Huang 等和Zhang等[7-8]报道的qSLA2.2、qSL2和qLW2是同一个位点。 在A02连锁群9.65～10.48 Mb区段检测到控制籽仁长的QTLqSLA02.1、籽仁长宽比的QTLqSLWA02.1和籽仁宽的QTLqSLWA02,为新的主效QTL。

本研究构建了一张高密度遗传图谱,共包含2 350个SLAF标签和61个SSR 标记,覆盖长度为1 814.72 c M。 共检测到20个控制籽仁大小的QTL,其中A02 染色体上Marker10593～Marker97229区间同时定位到控制籽仁长、籽仁宽和籽仁长宽比的相关QTL、Marker140970～Marker133566区间同时定位到控制籽仁长和籽仁长宽比的相关QTL。