oHSV2所携带的Fluc在皮下表达情况的研究

宋庆蕊，王润杨，刘滨磊*

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉滨会生物科技股份有限公司)

癌症是全球第一大死亡原因，已经严重影响到人类的生活[1]。其中，结直肠癌更是消化道常见的恶性肿瘤，发病率居全球肿瘤发病第3位，死亡率居肿瘤致死病因的第2位[2]。溶瘤病毒(oncolytic virus)能够特异性地在肿瘤细胞中复制并引起细胞病理效应和机体免疫反应，造成肿瘤细胞裂解[3]。

oHSV2是一种Ⅱ型单纯疱疹病毒，其在标准株HSV-2(HG52)的基础上，敲除了ICP47基因及ICP34.5基因并插入了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF)，从而使病毒可以在肿瘤细胞内选择性复制，促进抗原递呈并且提高了病毒的溶瘤活性[4]。oHSV2具有直接的细胞毒杀伤作用，可以调节肿瘤微环境并引起宿主的抗肿瘤免疫反应，形成免疫记忆从而产生持久的抗肿瘤疗效，其药物安全性评价多采用BALB/c小鼠作为动物模型，已证实具有较强的生物安全性[5]。

Fluc是一种较为常用的荧光素酶种类，由于Fluc基因表达的结果是产生化学发光，因而可以广泛应用于基因检测，作为一种报告基因和标记基因来研究基因的表达情况[6]，利用活体成像系统来检测荧光信号，此方法反应灵敏且易于检测[7]。实验室前期已经完成了表达FLuc的oHSV2构建工作[8]，本研究主要考察oHSV2所携带的Fluc是否可以在小鼠皮下进行表达。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和细胞

BALB/c小鼠购于湖北省食品药品安全评价中心，CT26细胞(北京协和医院细胞资源中心惠赠)。

1.1.2 试剂与仪器

DME/F-12培养基购自美国Hyclone 公司；胰酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自四季青公司；D-Luciferin购自碧云天(Beyotime)公司；PBS缓冲液购自美国Biosharp公司；oHSV2-Fluc(本实验室构建)。

二氧化碳培养箱购自日本松下公司；小动物活体成像系统购自PE珀金埃尔默股份有限公司；细胞计数仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；生物安全柜购自青岛海尔集团公司；恒温水浴锅购自新苗生物科技有限公司；台式高速离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司；常温冰箱购自青岛海尔集团公司；-70℃低温冰箱购自青岛海尔集团公司；倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯Olympus Corporation。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

CT26细胞由北京协和医院细胞资源中心惠赠，未检测出支原体。细胞培养基为含有10%胎牛血清的DME/F-12，将细胞放置于37℃ 5% CO2培养箱中静置培养。在倒置显微镜下观察细胞，待细胞汇合度达80%～90%时，按照1∶4的比例进行细胞传代。

1.2.2 植瘤前细胞处理

对所需要植瘤的CT26细胞进行培养，培养基为含有10%胎牛血清的DME/F-12。在植瘤前，收集细胞，离心条件为400g×5min，然后重悬于PBS中。调整CT26细胞浓度至2×107/mL。

1.2.3 CT26细胞植瘤

从湖北省食品药品安全评价中心购买20只6～7周龄的雌性BALB/c小鼠(体质量16～20g)，饲养于动物实验室内(配有IVC笼具及新风系统)，饲养1周左右，开始实验。随机选取10只植瘤：于BALB/c小鼠右侧肋背部皮下注射100 μL含有2×106个CT26的细胞悬液，待肿瘤生长至100mm3备用。

1.2.4 oHSV2-Fluc给药实验

分别给CT26荷瘤鼠组及健康BALB/c小鼠组注射100μL不同浓度(105CCID50、106CCID50)的oHSV2-Fluc，CCID50(cell culture infective dose 50%)为细胞培养半数感染量，主要用于检测病毒滴度。空白组注射100μL PBS/只，故每组采用2只小鼠。实验分组见表1。

表1 oHSV2-Fluc给药实验方案

1.2.5 活体动物成像系统检测Fluc产生的荧光信号

用无菌的D-PBS(不含Mg2+和Ca2+)溶解D-Luciferin，配制成15mg/mL的D-萤光素钾盐溶液，0.2μM滤膜过滤除菌，混匀后立即分装在-20℃保存。oHSV2-Fluc能表达萤火虫荧光素酶，先注射荧光素酶底物D-萤光素钾盐溶液再通过小动物活体成像仪可以观察到荧光信号。每只BALB/c小鼠腹腔注射D-萤光素钾盐溶液200μL，注射入体内10～20min后，待荧光信号达到最强稳定平台期，再进行成像分析。每次拍摄前腹腔注射D-萤光素钾盐溶液200μL，10min左右进行麻醉，再进行荧光拍摄。每隔24h使用小动物活体成像仪观察小鼠体内表达情况，连续观察7d。

2 结 果

2.1 BALB/c小鼠Fluc基因皮下表达的检测

使用小动物活体成像仪对BALB/c小鼠体内oHSV2所携带的Fluc基因进行检测，检测到给药后不同天数的荧光信号结果见图1(封二)。结果显示：高剂量给药的荧光信号强度高于低剂量给药的荧光信号，采用瘤内注射方式的荧光强度均强于同等剂量皮下注射方式的荧光强度。CT26荷瘤鼠空白组和健康小鼠空白组均未检测出荧光信号。随天数增加，小鼠体内荧光信号强度整体减弱，瘤内注射小鼠检测到的荧光信号在第6d时接近消失，皮下注射小鼠检测到的荧光信号在第3d时检测接近消失。荧光信号均集中在小鼠给药部位，未分布在其他部位。

2.2 Fluc基因在体内表达的荧光信号强度及趋势

检测到Fluc基因在瘤内及皮下表达的荧光信号强度见图2(封二)。结果表明：检测到Fluc基因表达的荧光信号随天数的增多而减弱，在第7d时，两种注射方式的小鼠体内荧光信号均已接近消失。在同等剂量的条件下，第1d的荧光信号强度均为皮下组强于瘤内组，而第1d后均为瘤内组强于皮下组。空白组均未检测到荧光信号。

检测到Fluc基因在瘤内表达的荧光信号强度，在同等剂量的条件下，高剂量给药的荧光信号强度高于低剂量给药的荧光信号，且高剂量给药与低剂量给药检测到的荧光信号强度随天数增加的变化呈现相似的趋势。小鼠体内荧光信号强度整体呈现下降趋势，而在第2d时荧光信号强度有稍增高的趋势，在第6d时已接近消失。

检测到Fluc基因在皮下表达的荧光信号强度，在同等剂量的条件下，高剂量给药的荧光信号强度高于低剂量给药的荧光信号，且高剂量给药与低剂量给药检测到的荧光信号强度随天数增加的变化呈现相似的趋势。小鼠体内荧光信号强度整体呈现下降趋势，在第3d时已接近消失。

3 讨 论

荧光素酶生物发光报告体系是一种灵敏度高、特异性强的检测方法，本研究采用FLuc作为报告基因，通过小动物活体成像系统检测oHSV2-FLuc发出的荧光信号，以验证外源基因是否可以在皮下表达。oHSV2提供了一种治疗恶性肿瘤的新型方法，其治疗食管癌、黑色素瘤和结直肠癌已经进入了Ⅱ期临床研究[9]。利用oHSV2进行肿瘤治疗，病毒安全性是一个非常值得关注的问题，提高病毒安全性尚需要更全面的研究。

现有的溶瘤病毒的临床给药大多数通过瘤内注射进行[10]，这给溶瘤病毒的安全性评价带来了极大的挑战，因为难以寻找完全合适的动物及肿瘤模型。食蟹猴具有发达的大脑且大脑的一些反应与人类比较相似，并且与人类的社会构建较为相像，是一种常用的化学类药物安全性评价动物模型，能够为药物的临床试验提供给药依据和剂量指导。基于其与人类基因组的相似性[11]，目前仍是药物安全性评价的首选模型。然而现在并没有成熟的食蟹猴肿瘤模型，因此，需要使用另一种给药方式来评估溶瘤病毒的安全性。所以本研究采用BALB/c小鼠肿瘤模型模拟外源基因表达。由于BALB/c小鼠具有成熟的肿瘤模型，因而对食蟹猴皮下基因表达的安全性评价可能有一定的指导及参考价值。