IGF-1预处理对大鼠心肺复苏术后脑水肿及炎症反应的影响*

陆辉志，李 伟，董 辉，曹 松，杨璐瑜，廖友霞，付守芝

(武汉大学附属同仁医院/武汉市第三医院急诊与重症医学科，湖北 武汉 430060)

在全球范围内，心脏停搏(cardiac arrest，CA)仍是导致死亡的主要原因[1]。近年来，随着心肺复苏技术(cardiopulmonary-cerebral resuscitation，CPR)的进步，CA患者恢复自主循环的比率有所提升，但幸存者通常发生严重的神经功能障碍[2-3]。复苏后患者出现神经功能障碍的病理生理机制极其复杂，其中，心搏停止后脑缺氧导致的水肿及炎症反应具有重要的致病作用。

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一个多效能激素，具有神经营养因子的作用，在神经细胞的生长、增殖、迁移及神经发生中发挥重要作用[4]。本研究将探讨IGF-1对心肺复苏大鼠脑水肿及炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

IGF-1：上海肯强贸易有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 ELISA检测试剂盒：武汉博士德生物技术有限公司；MPO检测试剂盒：武汉博士德生物技术有限公司；p-p65抗体及GAPDH抗体购自美国CST公司；多功能自动酶标仪购自美国MolecularDevices公司；高速台式离心机购自美国Beckman公司；Westernblot仪器购自美国Bio-Rad公司；水浴恒温摇床(SHY-2，江苏)，紫外分光光度计(CE 2041，英国)，呼吸机(HX-200)及BL-420E+生物机能试验系统(泰蒙公司，成都)。

1.2 实验动物及分组

36只清洁级雄性成年SD大鼠，体重250～300g，购自上海斯莱克实验动物中心[许可证号：SCXK(沪)2017-0005]，随机分为3组：假手术组(Sham组)、心脏停搏/心肺复苏组(CA/CPR组)和IGF-1处理组(IGF-1组)，每组各12只。相关动物实验内容已通过武汉市三医院动物实验伦理委员会审查。动物饲养在温度、湿度相对恒定的SPF级动物房内[温度(24±2)℃、湿度(55±5)%]，12h昼夜交替，自由进食水，术前禁食水8h。

1.3 模型制备及实验干预

2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，标准肢体导联监测心电图。气管切开插管；分离右颈动脉，接多导心电监护仪监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)；分离右侧股静脉，24号留置针穿刺置管，肝素封管备用，稳定10min后开始试验。IGF-1组经股静脉置管给予IGF-1，以40ng/g的剂量给药[5]，Sham组及CA组给予等同剂量的生理盐水。给药30min后于呼气末夹闭气管导管，通过窒息诱导心脏骤停。心脏骤停标准为:心电图示心电静止、室颤、心电机械分离；心尖区心脏搏动消失或MAP低于20mmHg[6]。心搏停止6min后开始心肺复苏，以食指按压胸部，200次/min；同时恢复机械通气，呼吸频率为50次/min，潮气量6mL/kg，吸氧浓度100%；经股静脉注射肾上腺素(0.01mg/kg)；如有必要，给予电除颤(5J)。如第一次除颤后不能恢复自主心跳，则在30s后重复一次。CPR成功标准:心电图出现正常的QRS波群，可触及到明显的心脏搏动或MAP升至60mmHg以上。如心肺复苏5min未成功，则停止复苏，宣告死亡。复苏成功后继续给予生命支持治疗。24h后取脑组织，-80℃冰箱保存。

1.4 检测指标

1.4.1 湿-干重比值法测定脑组织含水量

取适量脑组织，吸水纸吸干多余的水分，称重，记为湿重；将脑组织放在100℃的烤箱中48h，烤至恒重，再次称重，记为干重。脑含水量计算方法为：(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4.2 MPO活性检测

取适量脑组织，加入50mmol含0.5%十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide，HETAB)的PBS溶液(pH6.0)，超声波裂解匀浆，41 000g离心10min。取上清0.3 mL，加入2.3mL反应混合物，反应混合物含50mmol PBS、联甲氧基苯胺和20mmol H2O2溶液。在460nm处测量吸光度值，MPO活性以U/g蛋白表达[7]。

1.4.3 ELISA检测脑组织中炎症因子含量

严格按照试剂盒说明书，采用ELISA试剂盒检测脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10(武汉博士德生物技术有限公司，武汉，中国)水平。取适量脑组织，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，超声波破碎仪匀浆，4℃ 12 000g离心10min，取上清。测定OD值，根据标准曲线将OD值转换为浓度值。

1.4.4 Western blot分析

取脑组织100mg，使用蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，以30μg蛋白上样量计算上样体积。加上样缓冲液，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入p-p65及GAPDH一抗(均为兔抗，1∶1 000，CST公司)，4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入对应的二抗，室温孵育1h，ECL试剂发光显色，拍照，ImageJ软件分析测定条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织含水量的比较

与Sham组相比，CA/CPR组及IGF-1组脑组织含水量显著升高(P<0.05)；与CA组相比，IGF-1组脑组织含水量显著降低(P<0.05)。见图1。

与Sham组相比，*P<0.05；与CA/CPR组相比，#P<0.05，(n=12)

2.2 各组大鼠脑组织MPO活性的比较

CA/CPR组及IGF-1组MPO活性显著高于Sham组(P<0.05)，与CA/CPR组相比，IGF-1组MPO的活性显著降低(P<0.05)。见图2。

与Sham组相比，*P<0.05；与CA/CPR组相比，#P<0.05，(n=12)

2.3 各组大鼠脑组织炎症因子含量的比较

与Sham组相比，CA/CPR组及IGF-1组中炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量均显著升高；而与CA/CPR组相比，IGF-1组中3种炎症因子含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。而脑组织中IL-10的表达量与此相反，Sham组大鼠脑组织中IL-10的含量相对较高，与Sham组相比，CA/CPR组及IGF-1组IL-10的含量均显著降低(P<0.05)，但与CA/CPR组相比，IGF-1组中IL-10含量显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脑组织炎症因子比较

2.4 各组大鼠脑组织p-p65表达量的比较

与Sham组相比，CA/CPR组及IGF-1组p-p65的表达量增加(P<0.01)，而IGF-1组的表达水平较CA/CPR组显著降低(P<0.05)。见图3。

A.Westernblot典型条带图；B.p-p65相对表达量(与Sham组相比，*P<0.05；与CA/CPR组相比，#P<0.05)

3 讨 论

CA/CPR术后脑保护一直是世界性难题，也是研究的重点和难点，减轻CPR术后脑水肿及炎症反应对于改善幸存者预后具有重要意义。IGF-1是一种多效能激素，具有重要的生理学功能。近年来发现，IGF-1具有神经保护及神经修复作用[8]；Yang等[9]的研究表明，缺血性卒中可导致血循环中IGF-1含量减少，而经静脉给予IGF-1后，缺血脑组织及海马、大脑皮质中IGF-1水平明显升高，同时观察到大鼠的神经功能、认知功能及脑水肿得到明显改善。本研究采用CA/CPR模型，通过测定湿/干比并进行ELISA、Western blot等相关检测，验证了IGF-1能减轻大鼠CPR后脑水肿及炎症反应。

脑损伤是CA和心肺复苏CPR幸存者致病致死的重要原因，而CA/CPR术后脑水肿是幸存者脑损伤的重要表现，CA/CPR术后脑水肿通常提示预后不良。脑水肿可分为细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿，脑缺血主要导致细胞毒性脑水肿，而血管源性脑水肿通常出现在再灌注恢复以后[10]。CA/CPR引起全身组织器官缺血再灌注损伤，也称心脏停搏后综合征，既可导致细胞毒性脑水肿，又可引起血管源性脑水肿。弥漫性脑水肿可加重CA/CPR患者的脑损伤，且通常提示预后不良。本研究结果显示，CA/CPR后大鼠脑组织含水量显著增加；而IGF-1预处理则显著降低了大鼠脑组织含水量，从而验证IGF-1能改善CA/CPR后脑水肿，发挥脑保护作用。

MPO是中性粒细胞分泌的活性酶，它是中性粒细胞浸润及活化的重要标志。心脏停搏后血液循环中断，全身组织器官灌注不足，组织缺血必将导致氧化应激损伤进而产生大量炎症介质。复苏成功后，随着血供恢复，缺血期产生的炎症介质由损伤部位释放入血循环，损伤血管内皮细胞，致使血管通透性增加，中性粒细胞浸润。研究表明[11-12]，脑缺血将激活中性粒细胞，导致MPO活性升高，本研究结果与此一致，CA/CPR组大鼠脑组织MPO活性较Sham组显著增加，而IGF-1干预则显著降低了MPO的活性。

缺血再灌注损伤是CA/CPR的重要机制之一，脑供血中断导致脑组织氧供及能量供应不足，激活炎症通路，导致炎症介质的产生和释放，炎症反应进一步加剧CA/CPR后脑损伤。在CA及自主循环恢复(return of spontaneous circulation，ROSC)以后，白细胞、内皮细胞和组织细胞通过一系列信号转导通路感知损伤，释放大量细胞因子，进一步放大局部和全身反应[13]。本研究也证实，CPR组出现强烈的炎症反应，表现为ROSC后脑组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6表达显著升高，而抗炎细胞因子IL-10则明显下降，IGF-1干预则在一定程度上逆转了这一结局。由此表明，IGF-1预处理能抑制CPR后脑组织炎症反应。

NF-κB是重要的炎症信号通路，在生理情况下处于非活化状态，一经活化可调控多种炎症因子的表达。心脏停搏后，全身组织器官灌注减少，引起组织缺氧，进而激活NF-κB并使其转移到细胞核，促进炎性细胞因子的转录和翻译。先前研究表明[12-13]，CA/CPR后NF-κB通路激活。本研究结果与此一致，CPR后脑组织中p-p65表达量增多，而IGF-1预处理则明显抑制了NF-κB通路的激活。

综上所述，本研究结果表明，IGF-1预处理能减轻CA/CPR后脑水肿及脑炎症反应，发挥脑保护作用，其机制可能与抑制NF-κB通路有关。