酶解鸡肉粉替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉营养品质及肌肉生长相关基因表达的影响

杨烜懿 宋紫菱 植心妍 赵旭民 王光辉 迟淑艳* 谭北平*

(1.广东海洋大学水产动物营养与饲料实验室，湛江 524088；2.广东省水产动物精准营养高效饲料工程研究中心，湛江 524088；3.南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)，湛江 524025；4.宜昌华太生物科技有限公司，宜昌 443500)

鱼粉(FM)具有蛋白质含量高、氨基酸(AA)组成平衡、富含不饱和脂肪酸、抗营养因子含量低等优点，是水产动物尤其是肉食性鱼类的最佳蛋白质来源。鱼粉资源紧缺，导致价格不断攀升，给水产养殖业带来了巨大的成本压力，严重限制了水产饲料工业和养殖业的快速、可持续发展。尽管应用粮源性蛋白质饲料替代鱼粉在养殖动物上取得了较好效果[1]，一定程度缓解了因鱼粉的高额成本带来的经济压力。然而，随着人们生活水平的提高，动物性食品的占比逐年升高，人畜争粮日益严重，据推测，未来10年间，粮食单产的提升速度远不及饲用粮需求的增长速度[2]。粮食需求量的刚性增长，以及人们对动物性食品的需求，要求最大程度减少饲料工业对粮源性蛋白质饲料的依赖[3]。充分开发、高效利用非粮蛋白质源替代鱼粉对饲料工业，尤其是水产饲料行业的发展具有重大意义。

2020年中国渔业统计年鉴显示，海水养殖鱼类中，石斑鱼产量达18.31万 t，位居第二[20]。珍珠龙胆石斑鱼是石斑鱼养殖的主要品种之一，具有抗病力强、肉质鲜美、经济效益高、生长速度快和发展潜力大等特点[21]。鱼粉替代技术及石斑鱼产品品质的改善均影响着石斑鱼产业的进一步发展。因此，本试验以珍珠龙胆石斑鱼为研究对象，探究非粮蛋白源EP替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉品质及肌肉生长相关基因表达的影响，为开拓非粮蛋白质源的使用，研制石斑鱼资源节约型配合饲料提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

鱼粉和酶解鸡肉粉(100%来源于鸡胫骨肌肉，由宜昌某生物技术有限公司提供)的概略营养组成见表1，酶解鸡肉粉的肽分子质量分布见图1。配制以0(EP0组，作为对照组)、3%(EP3组)、6%(EP6组)、9%(EP9组)、12%(EP12组)、15%(EP15组)和18%(EP18组)酶解鸡肉粉等量替代鱼粉的7种等氮等脂的试验饲料。饲料原料经粉碎后，通过60目筛，按照表2准确称量，通过V型立式混合机(JS-14S型，浙江正泰电器股份有限公司)充分搅拌，加入预先称重的豆油、大豆磷脂、鱼油和水，二次搅拌混合，用膨化机制得直径为3.00 mm的颗粒。将颗粒饲料置于25 ℃空调房干燥48 h，直至水分含量约为10%，后储存于-20 ℃保存备用。

表1 鱼粉和酶解鸡肉粉的概略营养组成(干物质基础)Table 1 Proximate nutrient composition of the FM and EP (DM basis) %

表2 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

续表2项目 ItemsEP0EP3EP6EP9EP12EP15EP18营养水平 Nutrient levels2)水分 Moisture10.2710.5310.2510.7410.0410.2910.22粗蛋白质 Crude protein49.8249.4149.6550.0450.1349.9150.03粗脂肪 Ether extract10.4810.3510.5910.5110.6910.7410.90粗灰分 Ash9.399.239.038.738.428.127.82

图1 酶解鸡肉粉的肽分子质量分布Fig.1 Peptide molecular weight distribution of EP

1.2 试验用鱼及饲养管理

珍珠龙胆石斑鱼幼鱼购自广东省湛江市东南码头石斑鱼苗厂，鱼苗购回后在广东省湛江海洋高新科技园室外水泥池暂养2周，期间投喂石斑鱼商业饲料(广东粤海饲料集团，CP含量为50%)。养殖试验开始前，禁食24 h后将630尾初均重为(7.50±0.02) g的珍珠龙胆石斑鱼随机放养于21个玻璃钢桶(300 L)，每桶30尾鱼，每种试验饲料投喂3桶。每天表观饱食投喂2次(08:00和16:00)，共计56 d。并根据天气变化及吃料情况调整投喂量。每天每个玻璃钢桶中更换约70%的水。养殖期间，养殖水体温度为30.80～31.80 ℃，盐度为29～32，溶解氧含量高于6.15 mg/L，pH为6.80～7.20。

1.3 样品收集与分析

1.3.1 肌肉及饲料营养成分含量测定

饲养试验结束后，每桶随机收集3尾石斑鱼的背肌，储存于-20 ℃，以检测肌肉营养成分含量。使用AOAC(1997)[22]方法分析饲料和肌肉的营养成分含量。105 ℃恒重干燥法测定水分含量；索氏抽提法(抽提剂为石油醚)测定粗脂肪EE含量；凯氏定氮法(KjeltecTM8400定氮仪，瑞典)测定CP含量；550 ℃灼烧法(马弗炉)测定粗灰分含量。饲料中氨基酸组成按照GB/T 18246—2000[23]进行测定。肌肉中氨基酸组成按照GB 5009.124—2016[24]进行测定，脂肪酸组成按照GB 5009.168—2016[25]进行测定。EP的肽分子量分布采用《海洋鱼低聚肽粉》(GB/T 22729—2008)[26]进行检测。

1)维生素预混料和矿物质预混料由青岛玛斯特生物技术有限公司提供Vitamin premix and mineral premix were provided byQingdaoMaster Biotech Co., Ltd.

2)实测值 measured values。

1.3.2 肌肉系水力及质构特性测定

随机从每桶选择3尾鱼，取3.00～4.00 g背肌，准确称量，悬挂于充满空气的保鲜袋，于4 ℃冰箱悬吊24 h，再次称重背肌重量，以计算滴水损失[27]；另取3.00～4.00 g背肌，用保鲜膜包裹密封，于100 ℃水浴锅蒸煮5 min，冷却至室温，称重以计算蒸煮损失[28]。随机从每桶取6尾鱼，剥离背肌，剪切为3.00 cm(长)×3.00 cm(宽)×1.00 cm(高)的规格，通过质构仪(TMS-PRO，Food Technology Corporation，美国)对进行质构特性分析。

1.3.3 肌肉生长相关基因表达测定

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Primer sequences for qRT-PCR

1.4 计算公式

蒸煮损失(%)=(Wc1-Wc2)/Wc1；
滴水损失(%)=(Wd1-Wd2)/Wd1。

式中：Wc1是背肌蒸煮前重量(g)；Wc2是背肌蒸煮后重量(g)；Wd1是背肌悬挂静置前重量(g)；Wd2是背肌悬挂静置后重量(g)。

1.5 统计分析

所有数据均通过SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey法进行多重比较。P<0.05表示差异显著。结果以平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 酶解鸡肉粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉营养成分含量的影响

由表4可知，酶解鸡肉粉替代不同比例鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼背肌中水分、CP、EE和粗灰分含量没有显著影响(P>0.05)。

表4 饲喂不同饲料石斑鱼的肌肉营养成分含量(湿重基础)Table 4 Muscle nutritional component contents of groupers fed different diets (wet weight basis) %

2.2 酶解鸡肉粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉系水力和质构特性的影响

由表5可知，酶解鸡肉粉替代不同比例鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉的内聚性和弹性未产生显著影响(P>0.05)。EP6组的蒸煮损失显著低于EP0、EP3、EP9和EP18组(P<0.05)。EP12、EP15和EP18组的滴水损失显著低于EP3组(P<0.05)。EP6组的硬度与EP18组无显著差异(P>0.05)，但显著高于其他各组(P<0.05)。EP6组的胶黏性显著高于EP0、EP12和EP15组(P<0.05)。EP6组的咀嚼性与EP0和EP18组无显著差异(P>0.05)，但显著高于其他各组(P<0.05)。

表5 饲喂不同饲料石斑鱼的肌肉系水力和质构特性Table 5 Muscle water holding capacity and texture properties of groupers fed different diets

2.3 酶解鸡肉粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉氨基酸组成的影响

由表6可知，酶解鸡肉粉替代不同比例鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉中亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)以及总氨基酸、总必需氨基酸、总鲜味氨基酸和总芳香族氨基酸含量均未产生显著影响(P>0.05)。EP0组缬氨酸(Val)含量显著高于EP12组(P<0.05)。EP0和EP9组组氨酸(His)含量显著高于EP18组(P<0.05)。EP0组脯氨酸(Pro)含量显著高于EP18组(P<0.05)。

2.4 酶解鸡肉粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉脂肪酸组成的影响

由表7可知，随着酶解鸡肉粉替代鱼粉比例的增加，珍珠龙胆石斑鱼肌肉C15∶0、C17∶0、C20∶0和C16∶1n-7的含量逐渐上升，均在EP18组达到最大值，肌肉C22∶1n-9、C22∶6n-3(DHA)、∑MUFA、∑n-3 PUFA、总n-3高不饱和脂肪酸(∑n-3 HUFA)的含量及n-3/n-6 PUFA比值呈现先升高后降低的变化趋势。EP9组C22∶1n-9含量显著高于EP0、EP3、EP6和EP18组(P<0.05)。EP0组∑MUFA含量显著低于EP12和EP15组(P<0.05)。EP3组n-3/n-6 PUFA比值及DHA、∑n-3 HUFA和∑n-3 PUFA含量显著高于EP12、EP15和EP18组(P<0.05)。EP0、EP3和EP6组C24∶1n-9含量显著高于EP15和EP18组(P<0.05)。肌肉中其余脂肪酸以及总饱和脂肪酸(∑SFA)、∑n-6 PUFA含量及EPA(C20∶5n-3)/DHA比值未受到酶解鸡肉粉替代鱼粉比例的影响(P>0.05)。

表7 饲喂不同饲料石斑鱼的肌肉脂肪酸组成(干物质基础)Table 7 Muscle fatty acid composition of groupers fed different diets (DM basis) %

2.5 酶解鸡肉粉对珍珠龙胆石斑鱼肌肉生长相关基因表达的影响

由图2可知，珍珠龙胆石斑鱼肌肉中肌源性分化因子(MyoD)和肌细胞增强因子2c(MEF-2c)、Ⅰ型胶原蛋白编码基因α-2(Col1α-2)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)的相对表达量受饲料影响不显著(P>0.05)。EP6组肌细胞因子5(Myf5)和肌球蛋白重链(MyHC)的相对表达量显著高于EP12、EP15和EP18组(P<0.05)。EP15组肌细胞生成素(MyoG)的相对表达量显著高于EP0、EP3、EP6和EP9组(P<0.05)。EP0组肌细胞增强因子-2a(MEF-2a)的相对表达量显著高于EP3、EP6和EP9组(P<0.05)。EP0组Ⅰ型胶原蛋白编码基因α-1(Col1α-1)的相对表达量与EP12组无显著差异(P>0.05)，但显著高于其他各组(P<0.05)。EP0组卵泡抑素(FST)的相对表达量显著低于其他各组(P<0.05)。EP0和EP3组肌肉生长抑制素(MSTN)的相对表达量显著高于EP6组(P<0.05)。

数据柱形标注不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05),while with the same letters or no letters mean no significant difference (P>0.05).图2 饲喂不同饲料石斑鱼的肌肉生肌调节因子(A)、编码胶原蛋白(B)、肌肉生长正调控因子(C)和肌肉生长负调控因子(D)相对表达量Fig.2 Relative expression levels of myogenic regulatory factors (A), encoding collagens (B), positive regulators of muscle growth (C) and negative regulators of muscle growth (D) in muscle of groupers fed different diets.

3 讨 论

肌肉作为被食用的主要部分，其营养成分含量则是影响品质的重要因素[30]。在本试验中，随着酶解鸡肉粉替代鱼粉比例的增加，珍珠龙胆石斑鱼肌肉中水分、CP、EE和粗灰分含量无显著变化。在评价鱼类肌肉营养价值的指标中，蛋白质尤为重要。氨基酸作为蛋白质的基本单元，其组成和含量的变化影响着肌肉的营养价值[31-32]。研究表明，珍珠龙胆石斑鱼背肌中含量最丰富的氨基酸是Glu，其次是Asp、Lys和Leu[33-34]，本试验中也发现了相同的结果。风味是口腔的触觉、味觉和嗅觉的复合感觉[35]，肌肉中必需氨基酸、鲜味氨基酸和芳香族氨基酸的含量与风味密切相关[36]。Glu和Asp主要呈现的是鲜味，Gly和Ala呈现的是甜味，此外，Ser和Pro也与甜味的出现有关[37]。在本试验中，随着酶解鸡肉粉替代鱼粉比例的增加，必需氨基酸Val和His，总鲜味氨基酸及总芳香族氨基酸的含量均呈现下降趋势，意味着酶解鸡肉粉替代鱼粉后，珍珠龙胆石斑鱼肌肉的风味可能会受到影响。

各组试验饲料的EE含量保持不变，酶解鸡肉粉中小肽的高效利用可以节约蛋白质，充分发挥饲料中脂类的能量效应，促进脂肪的分解，使得珍珠龙胆石斑鱼肌肉脂肪酸组成发生变化[38]。有研究发现，不饱和脂肪酸(UFA)，尤其是PUFA，能够改善肌肉的风味[39]，肌肉的整体可接受程度及肉香味与C16∶1n-7含量呈正相关关系[40]。在本试验中，随着酶解鸡肉粉替代鱼粉比例的增加，肌肉C16∶1n-7含量呈现上升趋势，MUFA、∑n-3 PUFA和∑n-3 HUFA含量呈现先升高后降低的变化趋势，∑n-6 PUFA含量呈现先降低后升高的变化趋势。3%和6%酶解鸡肉粉等量替代鱼粉时，肌肉中∑n-3 PUFA和∑n-3 HUFA含量达到最大值。从上述结果可以得出，鱼粉被酶解鸡肉粉替代后，珍珠龙胆石斑鱼肌肉的风味会被改善，然而，肌肉中UFA含量增多，会存在被氧化的风险，产生醇类或者醛类的复合物，使肌肉气味变臭，影响肌肉品质[41]。此外，较高水平的n-3 PUFA具有抗炎作用[42]，高水平的n-6 PUFA可以引起血管收缩、血小板聚集和炎症反应[43]。人类食物中n-3/n-6 PUFA比值的推荐值为0.10～0.25[44]，比值越低，人类患高脂血症、肥胖症和乳腺癌的风险越高[45-46]。在本试验中，珍珠龙胆石斑鱼肌肉的n-3/n-6 PUHA比值为0.51～0.60。随着酶解鸡肉粉替代鱼粉比例的增加，n-3/n-6 PUHA比值逐渐变小，逐步向食物最佳n-3/n-6 PUHA比值靠近。

系水力是衡量肌肉品质的一个重要指标，能够反映肌肉中可溶性物质及液态物质的流失情况，对肌肉的营养成分的保留及风味的保持具有重要意义[47]。硬度、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性是肌肉的主要质构特性[48]，不仅影响水产品的外观，还影响口感。在本试验中，当6%酶解鸡肉粉等量替代鱼粉时，珍珠龙胆石斑鱼肌肉的蒸煮损失显著降低，硬度、胶黏性和咀嚼性均显著提高，提示EP6组珍珠龙胆石斑鱼肌肉的风味及其营养物质得到较好的保留，质地较硬，更具有嚼劲。

生肌调节因子(MRFs)及其相关调节基因是影响肌肉品质的内因[49]，对肌原细胞分化、肌纤维发育以及肌肉组织的形成和生长具有重要的调节作用[50-51]。MRFs家族的表达具有时序性，在体细胞形成过程中，首先表达的是Myf5，其次是MyoD和MEF-2c，然后是MEF-2a和MyoG，最后是MyHC[52]。其中，Myf5和MyoD主要作为生肌决定因子[53]，MyoG在肌细胞分化中起着重要作用[54]。在本试验中，6%酶解鸡肉粉等量替代鱼粉后，珍珠龙胆石斑鱼肌肉中Myf5和MyHC的相对表达量显著提高，改善了肌肉细胞的分化。IGF-1是一种重要的生长因子，在鱼类肌肉中具有多种受体，能促进细胞活化、增殖和分化，是MRFs的正调节因子[55]。相反，IGF-2是MRFs的负调节因子[56]。在本试验中，IGF-1和IGF-2的表达受饲料的影响不显著。鱼类肌肉中胶原蛋白的含量丰富，主要的胶原蛋白类型为Ⅰ型，由2条α-1链(Col1α-1)和1条α-2链(Col1α-2)编码[57]。胶原蛋白的合成和交联主要受TGF-β1调控，TGF-β1介导Ⅰ型胶原蛋白的表达[58]。在本试验中，TGF-β1和Col1α-2的表达受饲料的影响不显著，酶解鸡肉粉替代鱼粉后，下调了Col1α-1的表达，对胶原蛋白的形成产生负面影响。MSTN编码肌肉生长抑制素蛋白，是肌肉生长的负调节因子[51]。FST可以抑制MSTN对肌肉生长的负调节作用，促进肌肉的生长发育[59]。饲料中鱼粉被6%酶解鸡肉粉等量替代后，珍珠龙胆石斑鱼肌肉中MSTN的相对表达量显著降低，FST的相对表达量显著提高，表明6%酶解鸡肉粉等量替代鱼粉有利于珍珠龙胆石斑鱼肌肉的分化和生长，能够提高肌肉的生长。

4 结 论

① 6%的酶解鸡肉粉等量替代鱼粉能够显著改善珍珠龙胆石斑鱼肌肉的系水力和质构特性。

② 6%的酶解鸡肉粉等量替代鱼粉能够显著提高珍珠龙胆石斑鱼肌肉中MRFs家族及肌肉生长正调控因子的表达，抑制肌肉生长负调控因子的表达。