饲粮添加天然维生素E对蛋鸡产蛋后期生产性能、维生素E沉积、抗氧化功能和鸡蛋品质的影响

令狐克川 王 超 张瑞强 陈跃平 温 超 周岩民

(南京农业大学动物科技学院，南京 210095)

维生素E是一类化学结构相似的酚类化合物，具有多种生物学功能，可通过清除机体内自由基而提高机体抗氧化能力，有效预防或减轻机体氧化损伤[1]。此外，维生素E还可以通过调节机体信号通路增强机体免疫应答能力，发挥防治疾病的作用[2]。维生素E是蛋鸡必需的脂溶性维生素，饲粮中添加适量维生素E可改善蛋鸡生产性能和抗氧化能力，提高生产效率[3]。由于蛋鸡品种、生长阶段、饲粮组成和饲养条件等的不同，饲粮中维生素E的推荐量不尽相同[4]。维生素E有合成和天然2种类型，天然维生素E是从植物油精炼过程得到的脱臭馏出物中提取制得，含有α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚8种类似物，其中α-生育酚含量最高，活性也最高[5]。而合成维生素E通常以三甲基氢醌等石油化工副产物为原料通过缩合反应制备而成，主要成分是α-生育酚[6]。维生素E的合成工艺已相对成熟，其价格也较天然维生素E便宜，所以饲料中应用的主要是合成维生素E。但与合成维生素E相比，天然维生素E具有更高的生物活性和吸收利用率[7]。研究表明，饲粮中添加28 IU/kg合成维生素E可以提高蛋鸡生产性能和鸡蛋品质[8]。Cheng等[9]报道，饲粮中添加维生素E可以显著提高肉仔鸡的抗氧化功能和肌肉品质，且天然维生素E的效果优于合成维生素E。吴迪[10]研究报道，饲粮中添加天然维生素E可以提高蛋鸡产蛋率、血清生殖激素水平及鸡蛋品质。饲粮中添加150 mg/kg维生素E能有效提高蛋鸡抗体效价，提高机体免疫力[11]。在蛋鸡产蛋后期，因雌激素水平下降而导致其产蛋率降低，维生素E可通过调节垂体前叶分泌促性腺激素而提高蛋鸡繁殖能力[12]。研究已证实，维生素E能提高蛋鸡产蛋高峰期的生产性能及鸡蛋品质[3]，但有关维生素E对蛋鸡产蛋后期的影响则鲜见报道。天然维生素E在提高蛋鸡生产性能、抗氧化能力和改善蛋品质方面比合成维生素E效果更佳[10]。因此，本试验旨在探讨饲粮中添加天然维生素E对蛋鸡产蛋后期生产性能、维生素E沉积、抗氧化功能和鸡蛋品质的影响，以期为天然维生素E在蛋鸡产蛋后期生产中的合理应用和提高蛋鸡生产效率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验用天然维生素E产品(总生育酚含量≥30%，其中，α-生育酚含量为60%，β-生育酚含量为1%，γ-生育酚含量为37.5%，δ-生育酚含量为1.5%；其余70%为白炭黑和糊精)购于江西某生命科学有限公司。

1.2 试验设计和饲养管理

选取270只66周龄的海兰褐蛋鸡，随机分成3组，每组6个重复，每个重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮(含合成维生素E 30 IU/kg)，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E的试验饲粮。试验期为42 d。基础饲粮组成及营养水平见表1。试验在南京康欣禽业有限公司进行。所有蛋鸡饲养在同一鸡舍的3层阶梯笼中，自由采食和饮水，每天16 h连续光照。记录试验蛋鸡每天的产蛋数、产蛋量和死淘情况。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 样品采集

分别于试验第21天和第42天从每重复随机选取3个鸡蛋用于鸡蛋品质测定。试验结束时，于每重复中随机挑选1只体重相近且健康状态良好的蛋鸡进行屠宰。将蛋鸡分别称重后，采用颈静脉采血法收集血液于10 mL离心管中，并于4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min，将血清分装于0.5 mL离心管中保存在-20 ℃冰箱待测。待鸡死亡后剖开腹腔，用自封袋收集肝脏保存于-20 ℃冰箱待测，用洁净载玻片刮取空肠黏膜于无菌冻存管中，用液氮速冻并保存于-80 ℃冰箱待测。

1.4 指标测定

1.4.1 生产性能

分别以重复为单位记录每天的产蛋数和产蛋量，并统计各重复蛋鸡试验期间的耗料量，计算产蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。

1.4.2 维生素E沉积量

血清、肝脏和蛋黄中的维生素E含量采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定，测定方法严格按照说明书进行。

1.4.3 抗氧化指标

肝脏和空肠黏膜的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定，测定方法严格按照说明书进行。

1.4.4 抗氧化基因表达

根据Wen等[13]描述的方法，使用RNAiso试剂(大连TaKaRa生物技术有限公司)从空肠黏膜中提取总RNA。用微量分光光度计测定RNA的纯度和浓度，根据浓度计算出稀释至0.5 μg/μL所需要的焦炭酸二乙酯(DEPC)，将其稀释后用PrimeScript RT试剂盒(大连TaKaRa生物技术有限公司)进行总RNA的反转录。通过37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的反转录程序得到cDNA保存于-20 ℃冰箱备用。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，根据GenBank已登录的mRNA，用Primier Premier 5.0软件对引物序列进行设计。核因子E2相关因子2(Nrf2)、Kech样ECH结合蛋白1(Keap1)、血红素加氧酶-1(HO-1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化还原酶1(NQO1)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶1(GSH-Px1)的引物设计参考张相伦[14]。GenBank登录号、正向和反向引物的序列示于表2中。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(大连TaKaRa生物技术有限公司)在ABI 7300实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)中对反转录产物进行mRNA定量。PCR反应体系为20 μL。反应程序为95 ℃ 30 s、40个循环的95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，最终解离阶段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。用内参值进行校正，使用2-ΔΔCt方法分析相对于对照组计算的mRNA相对表达量。

1.4.5 鸡蛋品质

采用蛋壳强度测定仪测定蛋壳强度，多功能蛋品检测仪测定蛋重、哈夫单位、蛋白高度和蛋黄颜色，螺旋测微器测定蛋壳厚度，精密电子天平测定蛋黄和蛋壳重量。计算蛋黄、蛋壳和蛋清指数公式如下：

蛋黄指数(%)=(蛋黄重量/鸡蛋重量)×100；
蛋壳指数(%)=(蛋壳重量/鸡蛋重量)×100；
蛋清指数(%)=[(鸡蛋重量-蛋黄重量-
蛋壳重量)/鸡蛋重量]×100。

1.5 数据统计分析

试验数据采用Excel 2010软件进行初步整理，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法对分析结果进行多重比较，以P<0.05为显著差异，试验结果以平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期生产性能的影响

由表3可知，天然维生素E对蛋鸡产蛋后期生产性能无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，基础饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E使蛋鸡产蛋率分别提高了4.13%和3.01%，平均日采食量分别提高了2.15%和1.75%；基础饲粮中添加100 mg/kg天然维生素E使平均蛋重略有提高，料蛋比有所降低。

表3 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期生产性能的影响Table 3 Effects of natural vitamin E on performance of laying hens during late laying period

2.2 天然维生素E对产蛋后期蛋鸡血清、肝脏、蛋黄中维生素E含量的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可显著提高蛋鸡血清中维生素E含量(P<0.05)；饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E均可显著提高蛋鸡肝脏中维生素E含量(P<0.05)；饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E提高了蛋鸡蛋黄中维生素E含量，分别提高了18.10%和9.10%，但差异不显著(P>0.05)。

表4 天然维生素E对产蛋后期蛋鸡血清、肝脏、蛋黄中维生素E含量的影响Table 4 Effects of natural vitamin E on content of vitamin E in serum, liver and yolk of laying hens during late laying period

2.3 天然维生素E对产蛋后期蛋鸡肝脏和空肠黏膜抗氧化指标的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E均可显著提高空肠黏膜GSH-Px活性(P<0.05)；饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可显著提高肝脏GSH-Px活性和空肠黏膜CAT活性(P<0.05)，并显著降低肝脏MDA含量(P<0.05)。

表5 天然维生素E对产蛋后期蛋鸡肝脏和空肠黏膜抗氧化指标的影响Table 5 Effects of natural vitamin E on liver and jejunal mucosa antioxidant indexes of laying hens during late laying period

2.4 天然维生素E对产蛋后期蛋鸡空肠黏膜抗氧化基因表达的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E均可以显著提高空肠黏膜Cu/Zn-SOD的mRNA相对表达量(P<0.05)；饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可显著提高空肠黏膜Nrf2和GSH-Px1的mRNA相对表达量(P<0.05)；但饲粮中添加天然维生素E对空肠黏膜Keap1、HO-1、NQO1和CAT的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

表6 天然维生素E对产蛋后期蛋鸡空肠黏膜抗氧化基因表达的影响Table 6 Effects of natural vitamin E on jejunal mucosa antioxidant gene expression of laying hens during late laying period

2.5 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期鸡蛋品质的影响

由表7可知，与对照组相比，饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可显著提高试验第21天鸡蛋的蛋白高度、哈夫单位和蛋壳厚度(P<0.05)；饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可提高试验第21天的蛋壳强度、蛋黄颜色以及试验第42天的蛋黄颜色和蛋壳厚度，但差异不显著(P>0.05)。

表7 天然维生素E对蛋鸡产蛋后鸡蛋品质的影响Table 7 Effects of natural vitamin E on egg quality of laying hens during late laying period

由表8可知，饲粮中添加天然维生素E对试验第21天和第42天鸡蛋的蛋黄、蛋壳和蛋清指数无显著影响(P>0.05)。

表8 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期鸡蛋组成的影响Table 8 Effects of natural vitamin E on egg composition of laying hens during late laying period %

3 讨 论

3.1 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期生产性能的影响

饲料中添加维生素E可以促进动物生长发育，提高其生产性能。Jiang等[3]报道，饲粮中添加200 mg/kg维生素E可显著提高蛋鸡产蛋率。但关于维生素E对蛋鸡生产性能影响的研究结果并不完全一致。张桂芝等[15]研究发现，饲粮中添加不同水平维生素E对产蛋种鸡产蛋量和料蛋比均无显著影响。呙于明等[16]亦报道，不同水平维生素E对产蛋种鸡的采食量、产蛋率、平均蛋重和饲料转化率均无显著影响。本试验中，与对照组相比，饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E使蛋鸡产蛋率分别提高了4.13%和3.01%，平均日采食量分别提高了2.15%和1.75%，但差异不显著，提示饲粮中额外添加天然维生素E可在一定程度上提高蛋鸡产蛋后期的生产性能。造成以上结果差异的原因可能与动物品种、周龄和维生素E类型及添加水平等有关。

3.2 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期维生素E沉积的影响

研究表明，动物摄入的维生素E含量会影响其在动物组织中的沉积量，且维生素E在不同部位的沉积量亦有差异[17]。杨秋霞[18]的试验结果显示，饲粮中添加高水平维生素E可以显著提高蛋鸡心脏、肝脏以及蛋黄中维生素E的沉积量。本试验结果表明，蛋鸡血清中维生素E含量随着饲粮中天然维生素E添加水平的提高而增加，但天然维生素E添加水平从100 mg/kg增加到200 mg/kg时，蛋鸡肝脏中维生素E含量没有提高。谭芳等[19]报道，蛋鸡饲粮中分别添加0、41.66、83.32、124.98、166.64和249.96 IU/kg维生素E时，蛋黄中维生素E含量呈先上升后下降的趋势。Lin等[20]在基础饲粮中分别添加0、40、80和120 mg/kg的维生素E时，蛋黄中维生素E含量随饲粮中维生素E添加水平提高呈线性增加，但当添加水平为160 mg/kg时，蛋黄中维生素E含量降低。本试验研究亦得到类似结果，200 mg/kg天然维生素E组蛋黄中维生素E含量低于100 mg/kg天然维生素E组。因此，本试验结果表明，饲粮中添加100和200 mg/kg天然维生素E均能不同程度提高维生素E在蛋鸡组织中的沉积。

3.3 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期抗氧化功能及抗氧化基因表达的影响

机体内源性抗氧化酶包括SOD、CAT、GSH-Px等。SOD可以清除体内的超氧阴离子自由基或者催化其发生歧化反应生成活性较弱的过氧化氢(H2O2)；CAT和GSH-Px均可将H2O2分解为无毒无害的水(H2O)和氧气(O2)，GSH-Px还可以清除有机氢过氧化物[21-24]。MDA是机体内发生脂质过氧化反应生成的产物，其含量是反映机体脂质过氧化程度的重要指标[25]。维生素E作为抗氧化剂具有增强动物抗氧化功能的作用。吴迪[10]研究表明，饲粮中添加天然维生素E可以显著提高蛋鸡血清SOD活性，降低血清MDA含量。Zduńczyk等[26]报道，蛋鸡血清中SOD活性随饲粮中维生素E添加水平的增加而升高。本研究亦得到类似结果，饲粮中添加天然维生素E可提高蛋鸡产蛋后期空肠黏膜CAT、肝脏和空肠黏膜GSH-Px活性，并降低了肝脏MDA含量，提示饲粮中添加天然维生素E可以提高产蛋后期蛋鸡机体的抗氧化功能，且200 mg/kg的添加水平效果较好。

研究表明，维生素E可影响机体内源性抗氧化防御系统。该系统由一系列抗氧化酶、解毒酶和转运因子组成。抗氧化酶由Nrf2调节，Nrf2是一种氧化还原敏感的转录因子，是体内抗氧化和细胞保护系统最重要的调节因子[27]。在机体抗氧化机制中，Nrf2与抗氧化反应元件(ARE)形成Nrf2-ARE通路发挥重要作用，启动下游抗氧化酶基因的表达，包括HO-1、NOQ1、CAT和GSH-Px1等[28-29]。研究表明，维生素E能够通过抑制Nrf2启动区域的甲基化状态提高小鼠细胞内Nrf2和NQO1的mRNA相对表达量[30]。李黎云[31]报道，饲粮中添加400 mg/kg维生素E可提高育肥猪肝脏中GPX1和Nrf2的mRNA和蛋白的表达量，表明维生素E能够通过激活Nrf2、上调Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化基因的mRNA和蛋白表达量。本试验结果表明，饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可显著增加蛋鸡产蛋后期空肠黏膜中Nrf2、Cu/Zn-SOD和GSH-Px1的mRNA相对表达量，提示维生素E可以激活Nrf2-ARE通路，诱导启动Cu/Zn-SOD和GSH-Px1基因的表达。综上所述，饲粮中添加天然维生素E可以有效提高蛋鸡产蛋后期空肠黏膜抗氧化功能，可能与维生素E通过上调Nrf2的mRNA相对表达量、激活下游抗氧化基因的表达有关。

3.4 天然维生素E对蛋鸡产蛋后期鸡蛋品质的影响

蛋黄颜色是衡量鸡蛋品质的重要指标之一，消费者通常认为蛋黄颜色越深则鸡蛋品质越好。叶黄素是影响鸡蛋的蛋黄颜色的主要因素之一，其不能在蛋鸡体内合成，必须从饲粮中获取[32]。叶黄素在体内容易被氧化，影响蛋黄着色效果，维生素E可防止色素氧化损失。吴迪[10]报道，饲粮中添加维生素E可以显著提高鸡蛋的蛋黄颜色。元娜[33]研究亦表明，饲粮中添加维生素E能够显著提高蛋黄比重，并有加深蛋黄颜色的趋势。但也有研究表明，饲粮中添加维生素E对鸡蛋的蛋黄颜色和蛋黄比重均无显著影响[34]。本试验结果表明，饲粮中添加天然维生素E对蛋鸡产蛋后期鸡蛋的蛋黄颜色和蛋黄比重均无显著影响，这可能与蛋鸡周龄、维生素E类型和添加水平有关。

蛋白高度和哈夫单位是评价鸡蛋蛋白质量和新鲜度的指标，二者的数值越大表示鸡蛋品质越好[35]。Kirunda等[36]报道，在热应激条件下，随着饲粮中维生素E添加水平的增加，鸡蛋的哈夫单位也随之提高。Yan等[37]研究表明，饲粮中添加适量的合成和天然维生素E均可显著提高鸡蛋的哈夫单位。本试验中，饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E可显著提高试验第21天鸡蛋的蛋白高度和哈夫单位，提示天然维生素E对蛋鸡产蛋后期的蛋品质有较好的改善效果。蛋壳厚度和蛋壳强度是评价蛋壳质量的指标，蛋壳质量优劣对鸡蛋的储存、运输以及孵化均十分重要[38]。本试验结果表明，饲粮中添加200 mg/kg天然维生素E产品可显著提高试验第21天鸡蛋的蛋壳厚度，但对蛋壳强度无显著影响。Jiang等[3]报道，饲粮中添加维生素E对蛋壳强度无显著影响，与本研究结果一致。

4 结 论

饲粮中添加天然维生素E可在一定程度提高蛋鸡产蛋后期的产蛋率，促进肝脏中维生素E的沉积，增强机体抗氧化功能和改善鸡蛋品质。从提高蛋鸡生产后期的生产性能来看，以添加100 mg/kg天然维生素E的效果较好；从改善蛋鸡生产后期的抗氧化功能及鸡蛋品质来看，以添加200 mg/kg天然维生素E的效果较佳。综合考虑养殖经济效益和添加成本等因素，饲粮中以添加100 mg/kg天然维生素E为宜。