甜菜碱对宫内发育迟缓仔猪生长性能、肝脏损伤和抗氧化功能的影响

李 悦 张 昊 陈亚楠 陈跃平 杨敏馨

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014；2.南京农业大学动物科技学院，南京 210095；3.福建省畜牧总站，福州 350003)

现代繁育技术在提高母猪窝产仔数的同时，也导致弱仔猪数量不断增多。由于母猪子宫容积有限，胚胎生长空间及所需养分会随其数量增多而愈发不足，造成胎儿及其器官生长发育受阻，这一现象称为宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)。在生猪养殖中，低初生重或极低初生重是IUGR仔猪的典型特征，其出生后生长发育缓慢、存活率和抗病力较低，造成母猪繁殖资源和饲料资源的严重浪费[1]。研究表明，IUGR损伤新生仔猪肝脏功能，造成氧化还原稳态失衡、细胞凋亡和组织损伤增多等异常现象[2-3]。当胎儿暴露于营养不良的宫内环境时，机体会优先将有限的养分供给大脑、心脏等器官以维持自身存活，而减少对肝脏等代谢器官的养分供给，造成肝脏生理功能损伤[4]。作为机体重要的代谢、分泌及解毒器官，肝脏损伤是导致IUGR仔猪生长性能和抗病能力下降的一个重要因素[4]。因此，缓解早期肝脏损伤是改善IUGR仔猪生长发育和健康状况的可行途径。

甜菜碱(学名三甲基甘氨酸)是一种广泛存在于动植物及微生物中的季铵型生物碱，化学结构与氨基酸相似，具有提供甲基、维持细胞渗透压、调节蛋白质功能和酶活性以及改善脂质代谢等多种生理功能[5]。在畜禽养殖中，饲粮中添加适宜剂量的甜菜碱既可改善动物生长性能和胴体品质，也能节约胆碱和蛋氨酸的用量以降低饲料成本[6-7]。近年来研究发现，甜菜碱可通过调节肝脏含硫氨基酸代谢，提高抗氧化和解毒能力，改善多种不良因素造成的肝脏损伤[8-11]。然而，目前关于甜菜碱在IUGR仔猪上的应用研究较少。因此，本试验旨在探讨甜菜碱对IUGR仔猪生长性能、肝脏损伤和抗氧化功能的影响，以期为改善IUGR仔猪的生长发育与健康状况提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

从6窝符合正常初生重(NBW)和IUGR选择标准的三元(“杜×长×大”)杂交新生仔猪中，按每窝1头NBW和2头IUGR雄性仔猪的挑选方式，选择6头NBW[(1.51±0.04) kg]和12头IUGR[(0.85±0.05) kg]仔猪。NBW和IUGR的判定标准如下：初生重在群体平均值0.5个标准差之内为NBW仔猪，初生重低于群体平均值的2个标准差为IUGR仔猪[11-12]。所有仔猪自然哺乳至7日龄，随后将每窝的1头NBW和2头IUGR仔猪分至NBW对照组、IUGR对照组和IUGR试验组，每组6个重复，每个重复1头。NBW对照组和IUGR对照组饲喂基础配方乳，IUGR试验组饲喂在基础配方乳中添加1.0 g/kg甜菜碱(以乳粉干物质计)的试验配方乳。基础配方乳参照NRC(2012)断奶仔猪营养需要标准配制，其组成及营养水平见表1。各组配方乳临喂时按每100 g乳粉加入600 mL 45 ℃温水的比例配制，2～3 h瓶喂1次，每天饲喂8次，试验期15 d。试验期间，受试仔猪采用单栏饲养，舍温保持在27～29 ℃，免疫程序等其他管理按照常规方法进行。准确记录仔猪初体重(IBW)、末体重(FBW)以及采食量，计算7～21日龄的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

表1 基础配方乳组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal formula milk (DM basis) %

1.2 样品采集

试验结束时，于仔猪前腔静脉处采集5 mL血液置于肝素钠抗凝管中，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min收集上层血浆，保存于-20 ℃冰箱中备用。采血完成后，将仔猪电击致晕、放血致死，迅速分离肝脏，在左小叶处收集大约5 g组织置于预冷的Hank’s平衡盐溶液中，用于肝细胞分离，另取1.5 g左右肝脏样本收集至冻存管，液氮速冻后保存于用于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.3 指标测定和方法

1.3.1 血浆转氨酶活性的测定

使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。所有试验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.2 肝细胞活性氧(ROS)水平的检测

采用机械剪碎与Ⅰ型胶原酶消化相结合的方法制备肝细胞悬液，具体方法参见Zhang等[12]报道。采用2’,7’-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针测定肝细胞ROS水平。DCFH-DA自身无荧光，可自由穿过细胞膜，并被细胞内酯酶水解生成2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH)。DCFH不能通透细胞膜，故易装载至细胞内。DCFH易被细胞内ROS氧化，产生带有荧光的2’,7’-二氯荧光素(DCF)。因而，通过测定细胞DCF荧光强度可反映ROS水平。方法如下：在37 ℃条件下，使用工作浓度为10 μmol/L的DCFH-DA对肝细胞避光染色。孵育30 min后，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min以弃上清。洗涤完成后，使用600 μL PBS重悬细胞，采用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)在激发波长488 nm、发射波长525 nm条件下测定细胞DCF荧光强度。

1.3.3 肝脏抗氧化酶活性的测定

称取300 mg左右肝脏冻存样本，加入9倍重量体积生理盐水，在冰水浴条件下使用玻璃匀浆器制备组织匀浆液。4 ℃条件下4 000 r/min离心15 min，收集上清液用于抗氧化酶活性测定。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(γ-GCL)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)以及过氧化氢酶(CAT)活性。匀浆液蛋白含量采用碧云天生物技术研究所二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定。所有试验步骤均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 肝脏氧化还原代谢产物含量的测定

制备肝脏组织匀浆液，方法同1.3.3。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定肝脏丙二醛(MDA)、蛋白羰基(PC)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，试验步骤按照试剂盒说明书进行。匀浆液蛋白含量测定方法同1.3.3。

1.3.5 肝脏S-腺苷蛋氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量的测定

取冻存肝脏组织，加入4倍重量体积0.6 mol/L高氯酸，在冰水浴条件下制备为匀浆液，并在冰上静置1 h。4 ℃条件下14 000 r/min离心20 min，收集上清液，使用孔径为0.22 μm的微孔滤膜进行过滤。使用赛默飞UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞)测定溶液中SAM和SAH含量，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，条件如下：检测波长254 nm，柱温40 ℃，流动相分别为含有50 mmol/L KH2PO4、5 mmol/L庚烷磺酸钠的盐溶液(80%)和甲醇(20%)，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。SAM和SAH标准品购自Sigma-Aldrich(上海)。

1.4 数据统计分析

试验数据用平均值±标准误表示，采用SPSS 22.0软件中ANOVA方法进行单因素方差分析，采用Tukey方法进行事后检验和两两比较，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 甜菜碱对IUGR仔猪7～21日龄生长性能的影响

由表2可知，与NBW对照组相比，IUGR显著降低了仔猪IBW、FBW以及7～21日龄ADG和ADFI(P<0.05)，但对7～21日龄F/G无显著影响(P>0.05)。甜菜碱未显著改变IUGR仔猪21日龄FBW和7～21日龄生长性能(P>0.05)。

表2 甜菜碱对IUGR仔猪7～21日龄生长性能的影响Table 2 Effects of betaine on growth performance of IUGR piglets from 7 to 21 days of age

2.2 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪血浆转氨酶活性的影响

由表3可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪血浆ALT和AST活性显著升高(P<0.05)。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组仔猪血浆ALT活性较IUGR对照组显著降低(P<0.05)，而血浆AST活性无显著变化(P>0.05)。

表3 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪血浆转氨酶活性的影响Table 3 Effects of betaine on plasma aminotransferase activity of IUGR piglets at 21 days of age U/L

2.3 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏氧化应激标志物水平的影响

由表4可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝细胞ROS水平及肝脏MDA和PC含量显著提高(P<0.05)。与IUGR对照组比较，IUGR试验组仔猪肝细胞ROS水平和肝脏PC含量显著降低(P<0.05)，但肝脏MDA含量无显著差异(P>0.05)。

表4 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏氧化应激标志物水平的影响Table 4 Effects of betaine on oxidative stress marker levels in liver of IUGR piglets at 21 days of age

2.4 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏抗氧化酶活性的影响

由表5可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝脏γ-GCL和GR活性显著降低(P<0.05)，而肝脏SOD、GPx和CAT活性无显著差异(P>0.05)。与IUGR对照组相比，IUGR试验组仔猪肝脏γ-GCL活性显著提高(P<0.05)，但肝脏SOD、GPx、GR和CAT活性均无显著差异(P>0.05)。

表5 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏抗氧化酶活性的影响Table 5 Effects of betaine on antioxidant enzyme activity in liver of IUGR piglets at 21 days of age

2.5 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏谷胱甘肽代谢物含量的影响

由表6可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝脏总谷胱甘肽(T-GSH)和GSH含量以及GSH/GSSG值显著降低(P<0.05)，而肝脏GSSG含量显著升高(P<0.05)。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组仔猪肝脏T-GSH和GSH含量以及GSH/GSSG值均较IUGR对照组显著升高(P<0.05)，但2组之间肝脏GSSG含量无显著差异(P>0.05)。

表6 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏谷胱甘肽代谢物含量的影响Table 6 Effects of betaine on glutathione metabolite content in liver of IUGR piglets at 21 days of age

2.6 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏SAM和SAH含量的影响

由表7可知，IUGR对照组仔猪肝脏SAM含量和SAM/SAH值均显著低于NBW对照组(P<0.05)。与IUGR对照组相比，IUGR试验组仔猪肝脏SAM含量和SAM/SAH值显著提高(P<0.05)。

表7 甜菜碱对21日龄仔猪肝脏SAM和SAH含量的影响Table 7 Effects of betaine on contents of SAM and SAH in liver of IUGR piglets at 21 days of age

3 讨 论

3.1 甜菜碱对IUGR仔猪7～21日龄生长性能的影响

诸多研究表明，初生重是影响仔猪出生后生长性能的关键因素之一[1,10-12]。本试验中，IUGR显著降低了仔猪7和21日龄体重以及7～21日龄ADG和ADFI，这与前人研究结果[12-14]基本一致。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组仔猪7～21日龄ADG较IUGR对照组提高了7.2%，但未达到统计学显著水平，说明在7～21日龄阶段补充甜菜碱对IUGR仔猪生长性能无显著改变。因此，对于缓解IUGR仔猪生长阻滞或需较长时期的营养调控方可实现。

3.2 甜菜碱对IUGR仔猪肝脏损伤与氧化应激的影响

肝脏作为机体重要的代谢器官和分泌器官，直接影响动物生长潜能的发挥。血浆转氨酶活性是反映肝脏功能的重要指标[15]。正常生理条件下，ALT主要存在于肝细胞，AST主要存在于心肌细胞和肝细胞。当肝脏发生损伤，ALT和AST会因细胞膜破裂而大量释放进入血液，导致血液循环中转氨酶的活性随之升高[15]。本试验中，IUGR显著提高了21日龄仔猪血浆ALT和AST活性，提示IUGR仔猪肝细胞发生损伤。与此相似，IUGR仔猪在断奶后早期阶段依然伴有血浆ALT和AST活性显著升高的现象[16]。临床研究也证实，IUGR导致新生儿肝脏功能受损、代谢效率降低[17]。因此，若得不到及时、有效地缓解，IUGR仔猪肝脏损伤现象或在其出生后较长时期持续存在。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组血浆ALT活性较IUGR对照组显著降低，表明甜菜碱一定程度地缓解了IUGR仔猪肝脏损伤的现象。在啮齿动物上的研究也证实，甜菜碱能够减轻酒精、高脂饮食、有毒物质等不良刺激诱导的血液ALT和AST活性异常升高，有效保护动物肝脏功能[18-20]。

氧化应激是导致IUGR动物早期肝脏损伤的重要原因。正常情况下，ROS产生和清除处于动态平衡状态，对细胞及组织功能无负面影响。发生应激时，细胞氧化还原代谢失衡，造成ROS大量积聚以及蛋白质、脂质和核酸氧化损伤，破坏细胞稳态乃至组织功能。本试验结果显示，21日龄IUGR仔猪肝细胞ROS水平较NBW仔猪显著提高，肝脏MDA和PC含量显著升高。MDA是重要的脂质过氧化产物，其含量直接反映细胞脂质过氧化程度[21]。PC含量与蛋白质氧化损伤及酶失活密切相关，也是反映细胞氧化应激的敏感指标[22]。上述结果表明，IUGR仔猪肝脏存在明显的氧化应激现象。本试验还发现，添加甜菜碱可有效缓解IUGR造成的仔猪肝脏氧化应激，显著降低了肝细胞ROS水平以及肝脏PC含量，说明甜菜碱具有保护IUGR仔猪肝脏功能的作用。在大鼠上的研究也证实，饲喂甜菜碱有效改善了大鼠非酒精性肝损伤，肝脏氧化应激和纤维化程度均明显减轻[11]。

3.3 甜菜碱对IUGR仔猪肝脏抗氧化功能和含硫氨基酸代谢的影响

抗氧化能力不足是造成IUGR仔猪肝脏氧化应激的关键因素。本试验中，IUGR对照组仔猪肝脏T-GSH含量与GSH/GSSG值较NBW对照组均显著降低。在断奶仔猪上的试验结果也表明，IUGR导致仔猪肝脏GSH含量降低而GSSG含量升高[16]。GSH作为细胞内重要的非酶类抗氧化物，可通过清除自由基、还原过氧化物以及保护蛋白巯基等方式，发挥抗氧化保护作用[23]。发生氧化应激时，大量GSH被氧化，若无法被及时还原会导致GSSG积聚，GSH/GSSG值也随之降低。因此，GSH含量和GSH/GSSG值下降提示此时肝脏伴有剧烈的氧化应激，这也解释了IUGR对照组肝脏MDA和PC含量显著升高的现象。

含硫氨基酸代谢紊乱与IUGR仔猪肝脏T-GSH合成减少密切相关[24]。在动物体内，50%以上摄入的含硫氨基酸在肝脏代谢，主要分为转硫和再甲基化途径。蛋氨酸可在胱硫醚β合酶和γ-GCL的催化下，经转硫途径生成半胱氨酸，后者参与GSH、牛磺酸等生物活性物质的代谢，对维持机体氧化还原稳态具有重要意义[25]。在再甲基化过程中，蛋氨酸经蛋氨酸腺苷转移酶(MAT)作用产生SAM，其携带1个活化的甲基，广泛参与细胞内甲基转移反应。SAM在提供甲基后会转化为SAH，后者经水解产生同型半胱氨酸，并在甜菜碱或N5-甲基四氢叶酸提供甲基后完成再甲基化。本试验中，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝脏γ-GCL活性、SAM含量以及SAM/SAH值均显著降低，说明IUGR仔猪肝脏转硫和再甲基化途径均受抑制，导致GSH从头合成减少。与此相似，Maclennan等[26]研究发现，IUGR新生大鼠肝脏SAH、同型半胱氨酸和蛋氨酸含量增加，而半胱氨酸含量减少，进而阻碍了GSH合成。在仔猪上的研究也表明，IUGR导致肝脏半胱氨酸甲基转移酶和γ-GCL活性降低[24]。此外，本试验发现，IUGR显著降低了21日龄仔猪肝脏GR活性。GR是GSH氧化还原代谢过程中重要的还原酶，借助还原型辅酶Ⅱ(NADPH)将GSSG转化为GSH，以维持细胞GSH水平[27]。GR活性降低表明IUGR也会损伤仔猪肝脏GSH氧化还原代谢，导致肝脏GSH/GSSG值下降。

作为甲基供体，甜菜碱可有效补充蛋氨酸，并可促进MAT和γ-GCL表达，这不仅有助于改善甲基供给水平，也有利于GSH等生物活性物质的合成[5]。本试验中，添加甜菜碱显著提高了21日龄IUGR仔猪肝脏γ-GCL活性、T-GSH和GSH含量以及GSH/GSSG值，有效改善了GSH从头合成和氧化还原的代谢效率，继而增强了IUGR仔猪肝脏抗氧化功能。Jung等[8]也发现甜菜碱可通过促进GSH合成而发挥清除ROS作用。另外，本试验发现，饲喂甜菜碱后IUGR仔猪肝脏SAM含量显著提高，这与甜菜碱供甲基特性有关。除了作为有活性的甲基供体，SAM也具有抗氧化作用，可直接清除部分ROS或通过螯合铁离子而抑制羟自由基产生[28]。同时，SAM能够激活血红素加氧酶-1铁蛋白系统，减少NADPH介导的ROS产生，降低组织氧化应激和炎性反应[29]。此外，SAM可促进抑制素1表达，缓解应激造成的线粒体功能紊乱，减少电子传递链中ROS的生成[30]。综上所述，添加甜菜碱可有效改善IUGR仔猪肝脏含硫氨基酸代谢，促进转硫和再甲基化途径的代谢效率，提高GSH和SAM等生物活性物质含量，从而发挥保护肝脏作用。上述结果也解释了IUGR试验组仔猪饲喂甜菜碱后肝细胞ROS水平、肝脏PC含量以及血浆ALT活性降低的现象。

4 结 论

① IUGR会损伤21日龄仔猪肝脏含硫氨基酸代谢、谷胱甘肽从头合成及氧化还原循环效率，导致肝脏SAM、T-GSH和GSH等关键代谢物含量减少，抗氧化能力降低，引发肝脏氧化应激和组织损伤。

② 饲喂甜菜碱有助于改善IUGR仔猪肝脏SAM和T-GSH合成受阻的现象，提高肝脏抗氧化功能，降低肝细胞ROS水平、肝脏PC含量及血浆ALT活性，有效缓解IUGR仔猪肝脏氧化应激和组织损伤。