凉血消风汤对血热型银屑病患者外周血单核细胞NF-κB信号通路表达的影响

王亚翠，贾瑞璇，王文欢，王红梅

（1.四川省科学城医院，四川 绵阳 621900；2.天津市西青区中北镇社区卫生服务中心，天津 300393；3.大连市皮肤病医院，辽宁 大连 116021；4.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

银屑病是一种慢性、复发性、炎症性疾病，现代 研究发现与表观遗传因素有关，多种致病原因刺激机体的免疫系统，引起局部炎性反应和角质形成细胞的异常分化增生而形成此病[1]。核因子（NF）-κB是一种作用广泛的真核细胞转录因子，可以诱导成千上百种基因的表达，如生长因子、黏附因子和细胞因子等的转录[2]，其在调控免疫细胞的激活、凋亡、肿瘤的形成、炎性反应等方面发挥重要的作用[3]。目前发现，银屑病患者皮损中黏附分子和细胞因子异常表达，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1和神经生长因子（NGF）等，这些因子和分子的编码基因都含与NF-κB相结合的位点[4]。许多研究表明，银屑病患者皮损中NF-κB的表达明显增加，证明可能NF-κB的活化是银屑病病理形成的原因之一[5]。凉血消风汤是边天羽教授治疗银屑病血热证的有效方剂，临床应用数十载，疗效显著。其可以降低患者血清中干扰素（IFN）-γ、IL-2、IL-8、TNF-α等炎性因子，抑制炎性反应，还可以调节乙酰化内稳态，达到治疗银屑病的作用[6-8]。本课题以凉血消风汤治疗血热型银屑病患者，观察治疗前后银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分，并研究凉血消风汤对血热型银屑病患者外周血单个核细胞（PBMC）中NF-κB表达的影响，进一步探讨凉血消风汤治血热型疗银屑病的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料 收集2016年12月—2017年12月天津市中医药研究院附属医院银屑病专科门诊就诊的血热型进行期银屑病患者，10＜PASI评分＜30。正常对照组选取来源于本院健康体检人群。所有受试者均签署知情同意书，由经伦理委员会批准。银屑病组共收集32例，脱落4例。其中2例脱落为病情加重，口服西药治疗，2例自行退出。受试患者男16例，女12例；年龄14～57岁，平均（35.57±11.91）岁；病程 0.3～17.0 年，平均（5.76±4.60）年。正常对照组收集28例健康者。其中，男14例，女14例；年龄 21～60岁，平均（36.75±11.40）岁。2组间年龄及性别比较差异均无统计学意义，有可比性。

1.1.2 诊断标准 寻常型银屑病临床诊断标准：参照赵辨主编《中国临床皮肤病学》[1]，依据皮损形态、自觉症状、好发部位及病理表现等作为诊断标准。血热证诊断标准：参照《中药新药临床研究指导原则》[9]，血热证主症：新皮疹不断出现，以丘疹、斑丘疹为主，疹基底皮肤颜色鲜红；刮去鳞屑见点状出血，可有同形反应。次症：初发或复发，可有不同程度瘙痒，心烦口渴或口干，便秘尿黄，舌质红，苔黄脉数。具备以上主症及次症2项以上者即可诊断。

1.1.3 纳入标准及排除标准 纳入标准：①符合寻常型银屑病临床诊断标准，10＜PASI评分＜30，处于银屑病进行期；②符合血热证诊断标准；③年龄10～70岁；④3个月内无系统应用免疫抑制剂、糖皮质激素或维甲酸类药物治疗；⑤近1个月内无外用药物史；⑥身心健康，无严重心、肝、肾疾病，血尿便常规、肝肾功能及其他生化指标正常；⑦患者签署知情同意书。排除标准：①妊娠、哺乳期、孕妇或1年内计划妊娠者；②并有严重心、肝、肾疾患及恶性肿瘤患者；③有严重感染、水电解质及酸碱平衡紊乱者；④既往有病毒性肝炎等传染病病史；⑤其他证型银屑病，如血瘀型、血燥型等；⑥近2周内服过糖皮质激素药物，或1周内服过维甲酸类药物或外用过糖皮质激素制剂，4周内曾接受紫外光治疗或系统治疗者；⑦12周内曾使用生物制剂治疗者；⑧对本研究用药过敏者；⑨正在参加其他药物临床试验者或1个月内参加过其他临床试验者。剔除标准：纳入后发现不符合纳入标准，或未按本治疗方案规范实施的病例，需予剔除，其结果不计入最终统计分析。脱落标准：①不按时服用药物、复诊或自行退出；②患者病情加重需使用其他药物应急处理者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 银屑病组服用凉血消风汤（天津市中医药研究院附属医院院内制剂皮炎2号颗粒），6 g/次，2次/d，饭后 0.5 h用温开水口服。凉血消风汤的药物组成：生地30 g、白茅根30 g、玄参9 g、金银花 15 g、生石膏 30 g、知母 9 g、白芍 12 g、荆芥9 g、防风9 g、牛蒡子9 g、升麻3 g和甘草6 g。正常对照组为健康者，不采取任何治疗措施。

1.2.2 PBMC收集 银屑病组分别于治疗前和治疗后4周进行静脉采血，对照组只抽取1次。早晨空腹抽取静脉血于肝素抗凝管中，约3 mL，用密度梯度离心法，人淋巴细胞分离液（北京索莱宝）分离出PBMC，移入1.5 mL EP管，放入-80℃冰箱冻存，备用。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 临床观察指标 临床疗效评价指标：PASI评分。皮损症状疗效判定：采用PASI评分，于治疗前、治疗4周后，各进行1次评价。培训检测人员，使用经过色差矫正的数字化摄影设备对皮损面积、严重程度进行记录，并与日本引进的比色板进行比对，客观测评PASI评分。疗效计算公式（尼莫地平法）为：PASI积分=[（治疗前积分-治疗后积分）/治疗前积分]×100%。愈显率=（治愈例数+显效例数）/总病例数×100%。总有效率=（治愈例数+显效例数+好转例数）/总病例数×100%。痊愈：PASI积分下降＞90%。显效：PASI积分下降60%～89%。好转：PASI积分下降25%～59%。无效：PASI积分下降＜25%。

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）测定PBMC 中 IKKβ、IκBα、p50、p65的基因表达水平 从冰箱中取出PBMC，按Trizol（美国Invitrogen公司）说明书提取PBMC总RNA，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit（美国Thermo Scientific公司）说明书进行反转录合成cDNA。利用Premier 5.0软件设计引物，请上海生工公司设计合成。引物序列如下：内参基因（GAPDH） 引物序列：F：TGA GTC CTT CCA CGA TAC CA，R：ATC CCA TCA CCA TCT TCC AG；IKKβ：F：ACG ACC TAG AGG AGC AAG CA，R：AGC TCT GAA TTG CCT GAA GC；IκBα：F：CTC CAT CCT GAA GGC TAC CA，R：TCC TGA GCA TTG ACG TCA GC；p50：F：GAG GAT GGG ATC TGC ACT GT，R：TCT GTC ATT CGT GCT TCC AG；p65：F：TCA ATG GCT ACA CAG GAC CA，R：CAG CCT CAT AGA AGC CAT CC。使用Rt-PCR仪：Light Cycler 96（中国ROCHE公司）和Rt-PCR试剂SGExcel FastSYBR Mixture（BBI Life Sciences）建立 20 μL RT-PCR 扩增反应体系：预变性 95℃10min，（95℃10s，60℃20s，72 ℃ 15 s）×40 个循环。采用 2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。

1.3.3 Western blot测定 PBMC 中 IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65的蛋白表达水平 从冰箱中取出PBMC，按RIPA裂解液（上海生工）说明书提取细胞总蛋白，将蛋白质用SDS-PAGE（北京索莱宝）电泳，湿转法转膜，含5%脱脂奶粉的TBS（北京索莱宝）液封闭，结合一抗4℃过夜。IKBKB兔抗多克隆抗体（Cloud-CloneCorpPAJ822Hu01）1∶200；P-RELA 兔抗多克隆抗体（BBI.Co.Ltd D155097）1∶500；NF-κB1 兔抗多克隆抗体（BBI.Co.LtdD220134）1∶500；P-NFκBIA兔抗多克隆抗体（Cloud-Clone Corp A10017R）1∶500。TBS漂洗3次后滴加二抗（羊抗鼠-HRP（北京中杉金桥）1∶20000，羊抗兔-HRP（北京中杉金桥）1∶20000）孵育60 min，BIO-RAD ChemiDoc XRS凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）收集图像，结果用测得目标带的密度与β-actin的密度比值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件储存和分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示。若样本数据服从正态分布及方差齐性，则组间比较独立样本t检验，组内比较用配对t检验；若数据不符合正态分布及方差齐性，则组间比较采用2个独立样本秩和检验。应用SPSS相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后PASI评分比较 治疗前后PASI评分比较经正态性检验，符合正态分布，采用配对t检验，t=13.627，P＜0.01，有统计学意义，说明经凉血消风汤治疗后PASI评分下降明显，临床疗效显著。见表1。

表1 治疗前与治疗后PASI评分比较 （分，±s）

表1 治疗前与治疗后PASI评分比较 （分，±s）

组别 n PASI评分银屑病组治疗前PASI 28 19.3±5.34银屑病组治疗后PASI 28 9.7±2.77治疗前-治疗后 9.6±3.73

临床疗效判定：给予凉血消风汤治疗后评定PASI：痊愈0例，显效5例，好转23例，无效0例，愈显率17.2%，总有效率100.0%。说明凉血消风汤能够有效改善血热型银屑病患者的临床症状。

2.2 凉血消风汤对血热型银屑病患者PBMC中IKKβ、IκBα、p50、p65 mRNA 表达的影响 PCR 结果显示，与正常对照组比较，银屑病组治疗前PBMC中IKKβ、p50、p65的mRNA表达水平明显升高（P＜0.01或P＜0.05）；银屑病组治疗后与治疗前比较，IKKβ、p50、p65 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01或 P＜0.05）；IκBαmRNA 溶解曲线呈双峰，可能基因扩增的特异性不强，存在非特异性产物。见表2。

表2 凉血消风汤对血热型银屑患者PBMC中IKKβ、p50、p65 mRNA表达水平的影响 （±s）

表2 凉血消风汤对血热型银屑患者PBMC中IKKβ、p50、p65 mRNA表达水平的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01；与银屑病组治疗前比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n IKKβ p50 p65正常对照组 16 0.730±0.188 0.707±0.196 0.665±0.174银屑病组治疗前 16 1.078±0.312**0.913±0.261*1.010±0.271**银屑病组治疗后 16 0.709±0.293## 0.718±0.162#0.679±0.179##F 1.441 1.060 4.713 P 0.000 0.017 0.001

2.3 凉血消风汤对血热型屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65蛋白表达水平的影响 Western Blot结果显示，与正常对照组比较，银屑病组治疗前PBMC 中 IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表达水平升高（P＜0.01或 P＜0.05），银屑病组治疗后与治疗前比较，IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01 或 P＜0.05）。见表 3、图 1。

表3 凉血消风汤对血热型银屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65蛋白表达水平的影响 （±s）

表3 凉血消风汤对血热型银屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65蛋白表达水平的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01；与银屑病组治疗前比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n IKKβ p-IκBα p50 p-p65正常对照组 16 0.254±0.111 0.183±0.091 0.167±0.093 0.151±0.120银屑病组治疗前 16 0.554±0.095** 0.561±0.261** 0.464±0.098** 0.436±0.108**银屑病组治疗后 16 0.411±0.073## 0.363±0.199# 0.316±0.141## 0.273±0.116##F 0.180 4.016 0.048 0.154 P 0.000 0.000 0.001 0.001

图1 凉血消风汤对血热型银屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表达水平的影响

3 讨论

寻常型银屑病是在遗传背景下，多基因多环境因素相关的慢性复发性炎症性皮肤病，免疫炎性反应被认为是其发病机制之一[10]。NF-κB是广泛存在于细胞中的有多向调节作用的蛋白质分子，可参与机体多种免疫和炎性反应。NF-κB被视为银屑病炎症和免疫级联反应的“调控阀门”[11]。

NF-κB广泛存在于多种细胞中，NF-κB在哺乳动物细胞中最常见的是p65与p50结合形成p65/p50二聚体[3]。静息状态下NF-κB与其抑制蛋白I-κB结合形成三聚体存在于细胞核外，当细胞受到外源信号触发（如细胞因子、应激反应等）后，体内的免疫和炎性机制激活，蛋白酶的磷酸化使IKK活化，IKK能引起IκB磷酸化泛素化降解，NF-κB信号被激活形成游离状态的NF-κB p65，与DNA链上特异部位结合，启动基因转录。炎性信号再次正反馈作用于靶细胞进一步激活NF-κB信号通路，如此形成炎性反应持续放大的环形回路[12-13]。p65、IκBα的磷酸化水平是证实NF-κB通路活化的重要检测指标[14]。

有研究对银屑病患者的皮肤活体组织进行NF-κB的染色，发现NF-κB染色的表皮细胞与表皮增生的严重程度呈正相关，NF-κB染色的基底细胞与炎性浸润之间有显著的相关性，淋巴细胞染色与NF-κB染色的表皮和基底细胞有很强的相关性[15]。还有研究表明银屑病患者皮损区免疫组化发现NF-κBp65表达高于正常人表皮[16]，银屑病患者外周血NF-κB表达水平明显高于正常人，表明NF-κB可能参与了银屑病的发病。本项研究检测到银屑病患者 PBMC 中 NF-κB 信号通路中 IKKβ、p50、p65 mRNA表达水平显著高于正常人，同样发现IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65的蛋白表达水平显著高于正常人，说明NF-κB信号通路活化是银屑病发病的重要原因之一。

著名中西医结合皮肤病专家边天羽根据大量临床病例的积累，创造性地提出了皮肤病气血风热证，指出治法为凉血清热祛风，选用凉血消风汤[17]，方中3组药物，一是凉血之品，为白茅根、玄参、生地，配以解毒之金银花；二是清气之品，为生石膏、知母；三是祛风之品，为荆芥、防风、牛蒡子。本方组成体现了卫气血同治，给病邪以重创的思路。现代药理研究发现，清热解毒类如水牛角、玄参、双花有杀菌，抑菌，抗感染，增强白细胞吞噬能力的作用，能清除真皮乳头水肿，控制感染灶和抑制表皮细胞过度增殖。石膏可以使鼠T淋巴细胞数增加使巨噬细胞吞噬能力增强。凉血活血类如生地、白茅根等能调节机体细胞因子的水平，降低血浆内皮素从而抑制血管新生，同时对抑制角质形成细胞增殖与分化，改善微循环也有一定作用。活血药与祛风药同用，还有增强吞噬细胞功能和消炎的作用。

本研究发现，凉血消风汤可以明显降低血热型银屑病患者的PASI评分，证明其临床治疗效果明显。与银屑病患者治疗前比较，经凉血消风汤治疗后患者PBMC中NF-κB信号通路蛋白IKKβ、p50、p65 mRNA表达水平显著降低，同样发现IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表达水平显著降低。凉血消风汤能够降低血热型银屑病患者PBMC中IKKβ的mRNA及蛋白的表达，进而抑制了p-IκBα的表达水平，使 IκBα 的降解减少，p50、p65、p-p65 的表达降低，提示NF-κB通路活性降低，IκBα进入细胞核，与DNA竞争p50、p65，又重新结合为三聚体形式以静息状态回到细胞质中，从而NF-κB通路得到抑制。提示凉血消风汤能够抑制NF-κB通路的活性是其发挥治疗银屑病作用的机制之一。

综合以上实验结果，本研究证实凉血消风汤能够使银屑病患者PBMC中NF-κB通路活性降低，从而发挥其治疗银屑病的机制。本研究也有不足之处，实验主要检测了NF-κB的核心蛋白。今后笔者将重点研究NF-κB通路的上游蛋白是如何变化的，或者NF-κB通路与哪些信号通路有相互作用等方面，为银屑病的治疗提供更多的支持。