诱导多能干细胞移植后对急性前壁心肌梗死小鼠ST-T改变的影响分析

魏新伟，张晓刚，杨梁

（河南省安阳市人民医院 心内一科，河南 安阳 455000）

急性心肌梗死是当今世界上最常见的死亡原因之一，由于诱导多能干细胞（iPSc）的出现为干细胞移植治疗缺血性心肌病研究注入了活力。但是iPSc 移植治疗心肌受损也是一把双刃剑，移植后会不会发生畸胎瘤；其移植后对心肌组织急性缺血损伤有何影响？ST-T 改变是典型急性心肌梗死的基本心电图变化，并与其病理过程息息相关；前壁急性心肌梗死（AMI）心肌缺血、损伤、坏死的病理过程与ST-T 演变亦相对应。因此，以基本电生理指标ST-T 改变作为本实验的切入点研究iPSc 移植后对前壁AMI 心肌缺血损伤的影响具有准确、便捷、易测量等优点，稳定性和重复性亦很好，所以采用ST-T 改变的检测对AMI 心肌损伤进行研究值得进一步探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

取自由重庆医科大学实验动物中心提供癌症研究机构（Institute of Cancer Research,ICR）品系小鼠：雄性，体重25～30 g，8～12 周，共80 只，于重庆医科大学实验动物中心饲养。由中国科学院动物研究所北京干细胞库提供实验中使用小鼠iPSc 细胞系。

1.2 主要试剂、仪器及iPSc 细胞鉴定、移植前准备

1.2.1 主要试剂 ①培养基采用10%优质胎牛血清培养液、缓冲液应用磷酸缓冲液（PBS）液。②免疫组化法采用一抗为：兔抗缝隙连接蛋白43，容量0.2 mL；依次采用二抗为：生物素化羊抗兔免疫球蛋白G（IgG），容量6 mL。

1.2.2 主要仪器 ①体式镜：XTL-3A 重庆光学仪器有限公司。②电生理仪器：BL-420F 多导电生理仪及生物机能实验系统，产自成都泰盟科技有限公司。③细胞移植工具：微量进样器，容量50 μL，产自宁波市镇海玻璃仪器厂。

1.2.3 iPSc 细胞鉴定 首先形态学观察，其次功能学上用碱性磷酸酶染色进行最后移植前鉴定。

1.2.4 iPSc 细胞移植前的准备 首先采用SD 胎鼠成纤维细胞为饲养层的方法对iPSc 培养，其移植前应用显微镜下计数方法备用。

1.3 动物实验方法

1.3.1 实验分组 ①正常对照组（NCG）的设置：在造小鼠动物模型前按照数字随机化方法取20 只正常ICR 小鼠依次编号顺序为1～20，设为正常对照组，于移植后5 min、1 周、2 周、3 周各时间点取5 只小鼠用于对照；②其他实验组设置：将造模成功的实验小鼠按1～45 编号，用完全随机法分为假手术对照急性心肌梗死+生理盐水（AMI+NS）组、急性心肌梗死+移植iPS 细胞（AMI+iPSc）组及急性心肌梗死+移植成纤维细胞（AMI+Fb）组，每组15 只小鼠。经重庆医科大学动物实验中心伦理委员会批准，实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的标准［1］。

1.3.2 iPSc 移植方法 于小鼠左前降支结扎后30 min内采用微量注射器吸取浓度为2×1012/L iPSc 悬液10 μL，分别以其前壁肉眼可见轻微紫红色坏死区中心为圆点按12 点、3 点、6 点、9 点钟方向选择4 个点，每点用量2.5 μL 小心缓慢注射入心肌肌层。假手术对照组生理盐水的注射方法及作为比较的Fb 细胞移植方法均效仿iPSc 进行移植。

1.3.3 造模方法 ①造模的重要步骤：结扎小鼠左冠前降支方法采用8～0 丝线穿过前降支近端以及其下方少量肌束。②造模成功后标准：形态学上可见小鼠前降支对应供血区域前壁心肌由红润变为紫红色，略显一点苍白。体表心电图基本指标肢体导联Ⅰ、加压肢体导联（AVL）的ST 段抬高大于0.1 mV。③术后处理：手术后即刻及术后3 d，肌肉注射青霉素注射液8 万IU/d 预防感染。

1.3.4 心脏组织学标本采集 模型建立后1 周、2周、3 周时用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉动物，仰卧位将小鼠固定，气管插管，开胸暴露心脏。沿结扎缝合线层面以下剪取厚约3 mm 组织，用生理盐水冲洗干净，放置于4%的多聚甲醛溶液固定。制作石蜡切片，用于伊红（HE）染色。

1.4 指标检测

1.4.1 标本取材 心脏组织学标本采样于动物模型成功建立后1 周、2 周、3 周各个时间点时采集心肌标本。

1.4.2 各组小鼠心电图ST-T 改变记录、测量和分析 采用BL-420 生物机能系统多导电生理仪分阶段按时间点检测体表心电图I、AVL 肢体导联ST-T 演变的变化。

1.4.3 酶免疫组化法检测小鼠心肌组织缝隙连接蛋白（Cx43）的表达 AMI+NS 组、AMI+iPSc 组、AMI+Fb组等各组小鼠分别于模型建立后即刻、iPSc及Fb 移植后1 周、2 周、3 周各个时间点进行心电图ST-T 改变检测后迅速开胸切取心脏梗死区心肌组织，采用免疫组化Image-Pro Plus 图像数据分析系统对比分析并计算出平均光密度值（mean density）。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0 软件对本实验采集数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，iPSc 移植后各小组ST-T 改变指标应用单因素方差分析（ANOVA）进行多组间比较分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模前后心电图、iPSc 及成纤维细胞（Fb）移植前后ST-T 比较

造模前正常对照组及假手术对照（AMI+NS）组小鼠造模后特征心电图改变，见图1、图2。假手术对照组小鼠造模后即刻的ST 段压低及T 波倒置与NCG 组小鼠比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。iPSc 移植后梗死小鼠ST-T 变化的对比，iPSc 组于移植后2 周ST 压低、T 波倒置分别与假手术对照组心梗造模后即刻ST 压低、T 波倒置比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与iPSc 移植后2 周ST 段压低及T 波倒置指标改善效果相比较，AMI+Fb 组则无此效果。iPSc 及Fb 移植后对急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演变比较，见表1。

图1 造模前正常对照组小鼠心电图

图2 假手术对照组造模后小鼠特征心电图改变

表1 iPSc 及Fb 移植后对急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演变比较（±s,mV）

表1 iPSc 及Fb 移植后对急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演变比较（±s,mV）

注：†与移植前比较，P＜0.05。

2.2 iPSc 移植前后对ST-T 变化的影响

iPSc 移植前（造模后）即刻即开始了急性前壁心肌梗死小鼠缺血坏死的病理过程。ST-T 动态改变是反映心肌缺血的重要指标。通过对iPSc 及Fb 移植后2 周ST 段压低及T 波倒置的检测、对比发现，iPSc 移植后2 周对急性前壁心肌梗死小鼠缺血状况有所改善。iPSc 移植后与移植前（造模后）即刻及假手术对照组小鼠的ST 段压低及T波倒置的演变比较，见表2。

表2 iPSc 细胞移植前后AMI 小鼠ST-T 演变一览表（±s,mV）

表2 iPSc 细胞移植前后AMI 小鼠ST-T 演变一览表（±s,mV）

注：†表示与移植前比较，P＜0.05。

2.3 iPSc 移植后及Fb 移植后各个时间点ST-T变化比较

iPSc 移植后2 周ST 压低、T 波倒置分别与移植前（造模后）即刻ST 压低、T 波倒置及假手术对照组2 周ST 压低、T 波倒置相比较均有统计学意义（P＜0.05），见表3。而Fb 移植后1 周及3 周分别与前者及后者相同时间点比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表3 iPSc 细胞移植后与假手术对照组的指标变化比较（n=20,±s,mV）

表3 iPSc 细胞移植后与假手术对照组的指标变化比较（n=20,±s,mV）

注：†iPSc 移植后2 周与假手术对照组比较，P＜0.05。

表4 Fb 细胞移植后与假手术对照组的指标变化比较（n=20,±s,mV）

表4 Fb 细胞移植后与假手术对照组的指标变化比较（n=20,±s,mV）

2.4 iPSc 移植后及Fb 移植后Cx43 的表达

iPSc 移植后梗死小鼠心肌Cx43 的表达iPSc 组及假手术对照组比较，前者的测定值高于后者的测定值，差异有统计学意义（P＜0.05）。与此同时AMI+Fb 组Cx43 的表达与假手术对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 AMI+iPSc 组小鼠移植后2 周发生的ST-T 改变

3 讨论

急性心肌梗死是由于冠脉血流急剧减少或中断进而部分心肌发生急性坏死。干细胞移植治疗缺血性心脏病研究一直是该领域得到广泛关注的研究热点问题。日本科学家YAMANAKA 于2006年成功诱导多潜能干细胞（iPSc）引发了新的研究热潮［2］。随即iPSc 在移植治疗急性心肌梗死方面的研究引爆了能量。然而该研究亦是一把双刃剑，具有两面性，如：移植后会不会发生室壁瘤？其次是移植后对急性心肌梗死小鼠缺血损伤有无改善？ST-T 改变是反应急性心肌梗死（AMI）心肌急性缺血损伤特征性心电图演变。采用ST-T 改变作为观察指标，研究iPSc 移植对急性前壁AMI 小鼠急性心肌缺血损伤的影响为解答这些问题提供了强有力的依据。

作为外源性物质的iPSc 移植首先遭到质疑是能否导致宿主发生畸胎瘤。新近研究由人类诱导的多能干细胞分化出的神经干细胞或祖细胞在移植治疗脊髓损伤的致肿瘤作用可被单纯疱疹病毒胸苷激酶防止形成［3］。人类诱导的多能干细胞分化成心肌细胞及间充质细胞在急性心肌梗死中作用比较中均未发现致畸胎瘤现象进一步证实了这一点。其次就是其移植后所形成的干细胞异化细胞电生理学不稳定，具有混杂性［4］。但iPSc 移植后可明显改善心肌急性缺血损伤基本指标ST 段压低、T 波倒置，其原因分析如下。

心电图ST-T 改变主要反映的是心肌细胞的复极过程，Cx43 是构成心脏电生理结构缝隙连接的主要组成部分，其主要反映心肌细胞活化的电耦联活动。AMI 时心肌细胞受到严重损伤，进而Cx43 表达异常，对心肌细胞的电活性及其复极化过程产生严重影响，最终引起心脏电重构。首先分析iPSc 移植后对受损心脏心肌重构影响：从受损心肌整体上看，有研究发现iPSc 移植后从形态学观察上心肌受损部位再生组织，进而阻止受损心肌功能损伤进程，恢复缺血心脏功能［5］。而Fb细胞移植后则无此功效。再者从受损心肌重构微观上分析：分别从iPSc 移植的有效性、定向性、融合性各方面分别来阐述：iPSc 移植的有效性是首先关注的热点问题之一。新生小鼠大脑移植了来源于人iPSc 的小胶质细胞后会分化呈现出初级小胶质样状态，对其移植的有效性给予了很好的证明［6］。在心肌微循环中利用iPSc 发挥作用的小血管角度设计小鼠心肌薄片分化为心肌细胞并对AMI 小鼠心肌组织产生功能影响，提高心肌梗死边缘带微血管密度，稳定梗死面积［7］。以上两项研究充分证明iPSc 来源的细胞移植后不仅有效，而且可以改善受损心肌细胞的功能。iPSc 移植的定向性研究是热点问题，更是难点问题。各个领域均有发现：培养自人类iPSc 细胞不是向臆想中的肾上腺细胞分化，反而分化为分泌雄激素的间质细胞，成为印证iPSc 分化定向性的研究亮点［8］；取自于人类iPSc 分化的耳源上皮祖细胞移植可使老鼠的听觉缺失障碍得到明显改善［9］更充分证明了其移植后定向性分化的问题。来自血液学方面发现多能干细胞可来源于人外周血单核细胞，对iPSc 正向分化充分性研究得到证实；但其也可定向分化成树突状细胞和单核细胞，从而对其逆向必要性研究也得到了进一步证实［10］。最后是其移植后融合性方面研究：iPSc 来源的外泌体在心力衰竭的精准治疗为其移植后组织及细胞相融性提供了非常有力的依据［11］。

再者分析iPSc 移植后对受损心脏电重构影响：Cx43 发生重构，必然会引起心肌细胞的电耦联障碍，导致急性心肌细胞损伤［12］。Cx43 表达增加可能是iPSc 移植后增加电活动稳定性主要原因之一。iPSc 移植后不仅可改善小鼠急性心肌梗死受损心肌的电重构而且增强了其电位稳定性，从电生理角度为心电图ST-T 改变提供了直接依据。

iPSc 移植后改善基本电生理指标ST-T 主要机制是其旁分泌作用。新近研究证实旁分泌是iPSc移植后修复受损心肌组织发挥作用主要方式，其作用机制将成为今后研究的重点方向［13］。但其作用因子及时间怎样发挥作用还不清楚。其正向调整作用表现在对心肌细胞效应持续时间正向调整作用，而心肌细胞亦可改善存活iPSc 离子通道功能从反方面亦很好的证实了旁分泌发挥的重用作用［14］，进而改善急性缺血损伤心肌细胞的功能。新的研究显示诱导多能干细胞移植后对帕金森患者的有益影响及早期的临床应用从神经学方面再次证实了该移植细胞的有效作用［15］。iPSc 移植后2 周ST 压低、T 波倒置分别与移植前（造模后）即刻及假手术对照组2 周比较均有统计学意义；而移植后1 周及3 周分别与前者及后者相同时间点比较均无统计学意义。心电图ST-T 改善的这个时间节点为旁分泌作用产生一系列细胞调节因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、肝细胞生长因子（HGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及以上诸多因子在心肌修复方面发挥基础作用［16］的研究提供了很好的路标指引。同时心电图ST-T 指标改善为iPSc 移植后通过旁分泌产生的这些因子可增强急性缺血损伤心肌细胞电位稳定性、改善并修复其功能提供了新的证据。

但iPSc 移植治疗缺血性心肌病临床应用之路还很漫长，有许多技术难题亟待解决：如为其临床应用提供最佳的种子细胞；研究外膜细胞移动至不同组织进而促进血管再生的旁分泌作用机制等。iPSc 移植对受损心肌重构及电重构的影响，进而改善其血供机制还需要进一步临床试验印证。