ESAT-6蛋白及mRNA在肺结核诊断中的临床价值

刘洪璐，罗 煜，夏加伟，陆霓虹

（昆明市第三人民医院 1．呼吸与危重症医学科；2．肿瘤科；3．重症医学科，云南 昆明 650041）

肺结核是严重危害人类身体健康的乙类传染病。中国是全球30个结核病高负担国家之一，结核患者占全球9%，发病人数86.6万例[1]。有学者曾报道早期分泌性抗原靶6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）对肺结核尤其是菌阴肺结核诊断的特异性和灵敏度均较高，可作为肺结核的辅助诊断方法[2]。项目组前期对ESAT-6与肺结核病程进展之间的关系进行了研究，发现ESAT-6蛋白在涂阳患者外周血中表达量高于涂阴患者[3]。但未见外周血ESAT-6蛋白及其mRNA用于诊断肺结核的报道。本研究通过比较肺结核患者及健康体检者外周血ESAT-6蛋白及mRNA表达，并与传统痰检（包括痰涂片和痰培养）、灌洗液X-pert检查、斑点试验等检测方法进行对比，评估ESAT-6蛋白及其mRNA 在肺结核诊断中的临床价值，现报告如下。

1 方法与步骤

1.1 病例来源

选择昆明市第三人民医院2018年1月-2019年1月收治的诊断为肺结核的患者41例。肺结核诊断按2017年肺结核诊断标准（WS288-2017）[4]进行。体检中心胸部X线无异常健康对照者20例，2组之间性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。抽取空腹静脉血分别进行ESAT-6蛋白和mRNA 检测。结核患者完善痰涂片、培养、灌洗液X-pert 检查、斑点试验等结核相关检测，完善血常规、感染指标、血沉、凝血等指标。该研究已通过医院伦理委员会审核（编号2017091403），所有入组患者均签署知情同意书。

纳入标准：⑴符合上述诊断标准的各组人群；⑵年龄18-80岁；⑶首次发病就诊，未抗结核治疗，检查资料完整。

排除标准：⑴检查资料不完全或上述检查未完成患者；⑵合并其他肺部病变或其他系统严重疾病不能配合者；⑶未签署知情同意书。

1.2 主要设备及试剂

电热恒温鼓风干燥箱、高速冷冻离心机、酶标仪、定量PCR仪、紫外分光光度计；人ESAT-6酶联免疫分析试剂盒、Trizol、天根逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 血样处理

抗凝管收集3mL空腹血液标本，4℃2000rpm转速离心5min，收集上清（血浆）用于RNA提取。血清管收集3mL空腹血液标本，4℃2000rpm转速离心5min，收集上清（血清）用于酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.3.2 ESAT-6 RNA表达量

广州invitrogen公司设计并合成引物，引物序列：

ESAT-6 F Primer：5'-GAGCAGCAGTGGAATTTC-3'

ESAT-6 R Primer：5'-GTCAAGGAGGGAATGAATG-3'

用总RNA 提取试剂（total RNA extraction reagent，Trizol）一步法抽提总RNA。按照FastKing RT Kit（With gDNase）试剂盒说明，进行ESAT6 mRNA 的提取检测。采用2-△△Ct法分析结果，2-△△Ct＝2-［（Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）］。

1.3.3 ESAT-6蛋白表达量

按人ESAT-6酶联免疫分析（ELISA）试剂盒说明书检测ESAT-6蛋白并计算ESAT-6蛋白含量。

1.4 统计学方法

应用SPSS22.0软件统计分析，偏态分布的计量资料以“中位数（四分位数）》［M（Q1，Q3）］表示，2 组间差异的比较采用Mann-Whitney U检验。年龄、性别基线比较采用卡方检验，不同检测方法之间的比较采用McNemar检验，相关性分析采用Spearman 秩相关P＜0.05为差异有统计学意义。检验效率及界值使用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析。

2 结果

2.1 ESAT-6蛋白及mRNA在2组患者中的表达情况

肺结核患者ESAT-6 蛋白表达量为26.061（21.785，24.547）pg/mL，显著高于健康对照组的0.000pg/mL（P＜0.001）；肺结核患者ESAT-6的mRNA 相对表达量为8.271（2.206，24.547），高于健康对照组的0.064（0.036，1.509） （P＜0.001），因此ESAT-6可用于肺结核的诊断，且蛋白优于mRNA，见图1的A、B。

图1 A．ESAT-6 蛋白在2 组人群中的表达量；B．ESAT-6 mRNA 在2 组人群中的相对表达量

2.2 ESAT-6 mRNA表达与其他结核检测手段之间的关系，见表1。

表1 肺结核不同检测方法与ESAT-6 mRNA、ESAT-6 蛋白表达之间的关系

肺结核患者ESAT-6的mRNA阳性率为87.8%，与传统结核检测方法痰检、X-pert相比，阳性率不同（P＜0.05），高于痰检的36.59% （15/41） 和X-pert 检测的24.39% （10/41），与斑点试验、ESAT-6 蛋白相比差异无统计学意义。肺结核患者ESAT-6 蛋白检测阳性率为92.68%，与传统结核检测方法相比阳性率不同（P＜0.05），高于痰检的36.59%、斑点试验的68.29% （28/41）和X-pert检测的24.39%。

2.3 ESAT-6蛋白及mRNA对肺结核诊断的敏感性和特异性

ESAT-6蛋白诊断肺结核的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为0.963［＜0.001，95%CI（0.915，1.000）］。ESAT-6 mRNA诊断肺结核的AUC 为0.894［P＜0.001，95%置信区间（0.817，0.971）］，两者均对肺结核患者有较高的诊断价值，且ESAT-6 蛋白诊断效率优于mRNA。根据ROC曲线计算约登指数和乘积指数最大值、欧氏指数最小值、综合三者确定最佳阈值，并计算灵敏度和特异性。ESAT-6蛋白的cut off值为9.272 pg/mL，此时灵敏度为92.68%，特异性为100.00%。ESAT-6 mRNA 的cut off值为2.004，此时灵敏度为78.05%，特异性为85.00%，见图2。

图2 ESAT-6蛋白及mRNA对肺结核诊断的ROC曲线

3 讨论

ESAT-6属于ESAT-6/WXG-100超家族成员，结构包括具有保守结构的Trp-X-Gly序列和对生物的活性构象、分泌和分枝杆菌毒力至关重要的Leu29 序列[5]，与结核分枝杆菌（M.tuberculosis，MTB）的毒力和致病性相关。ESAT-6可与层粘连蛋白结合引起肺上皮细胞溶解，在MTB的传播中起作用[6]。因此，检测ESAT-6表达可用于人类是否感染MTB 的诊断，以及进一步评估感染后病情严重程度。

ESAT-6作为毒力因子，仅在致病性MTB中表达，所以肺结核患者组均见升高，而在健康对照组因未感染MTB，检测无ESAT-6蛋白表达，与文献报道相符[7]。本研究显示肺结核患者ESAT-6蛋白检测阳性率高于mRNA，考虑mRNA在血液中半衰期较短，不容易检测到，而翻译成蛋白质后性质较稳定，因此部分患者mRNA表达量不高。

斑点试验是一种以T细胞免疫应答为基础的γ干扰素释放实验。一项Meta分析显示斑点试验对菌阴肺结核辅助诊断的灵敏度为87.4%、特异度为84.5%，有较高的诊断价值[8]。本研究结果显示，斑点试验阳性率仅为68.29%，符合文献报道，但与ESAT-6 蛋白与mRNA检测阳性率比较相对偏低，提示ESAT-6蛋白与mRNA检测与常规检测方法比较准确率更高。

文献报道脑脊液中ESAT-6 蛋白敏感性在67.35%-88%之间[9]，与患者脑脊液MTB浓度相关，当浓缩脑脊液后其敏感性可达到100%[10]。浓缩的脑脊液及胸水中ESAT-6 蛋白检测的灵敏度为72.4%，特异度为90%[11]。有学者检测痰液培养标本中的ESAT-6蛋白，其敏感性为84.4%，特异性为95.9%[12]。在本研究中，根据ROC曲线计算，当外周血ESAT-6蛋白的cut off值为9.272 pg/mL时，具有较高的检测效能，灵敏度、特异性分别为92.68%和100.00%。因此，直接检测ESAT-6蛋白表达有助于结核的诊断。

菌阴性肺结核患者在结核患病人群中占比超过60%，因缺乏临床诊断证据诊断困难。通过本研究结果发现，ESAT-6蛋白和mRNA检测与其他传统检测手段相比，阳性率明显高于痰涂片和X-pert诊断。在26 例痰检阴性肺结核患者中有23 例ESAT-6 mRNA 阳性，25例ESAT-6蛋白阳性，提示ESAT-6 与mRNA可联合用于菌阴肺结核的辅助诊断，提高临床确诊率。

综上所述，外周血ESAT-6蛋白及mRNA检测在肺结核患者中诊断阳性率优于其他传统检测方法，可用于诊断肺结核，尤其是菌阴肺结核的确诊，从而减少肺结核的漏诊及误诊，具有较高的临床价值及意义。