金银花变色与5-羟甲基糠醛等有效成分含量的相关性研究

罗弈皓，刘楠，袁枫林，陈蓓蓓，吴沁璇

（长沙医学院，湖南 长沙 410219）

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花，是临床常用的具有抗菌、抗病毒、护肝、抗氧化等作用的大宗中药材之一［1］。在新型冠状病毒COVID-19治疗中，金银花临床使用量非常之大［2］。中药材的色泽是近代以来一直用于鉴定中药材质量品质的重要指标，但是长期以来缺乏数据化的指标［3］。基于这个问题，近年来，在中药研究鉴定中提出了一种基于色度学原理的分析方法，以L*、a*、b*三种参数分别表示明度、红绿、黄蓝方向，可用于药材颜色的快捷检测［4］。这种方法已在药材颜色与质量评价中占据重要地位［5-7］。因此本研究收集了色泽不同的金银花，对金银花颜色值进行测量，同时通过HPLC法测定金银花中绿原酸和5-羟甲基糠醛含量，并分析金银花色度值与颜色相关的有效成分含量的相关性，以期为金银花的质量评价提供新依据和新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

SPD-M20A型HPLC高效液相色谱仪（日本岛津）；AS系列超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FB224型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；UV-7500型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；LS171色差仪（深圳林上科技有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20782，纯度≥98%）；

5-羟甲基糠醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：H2020335，纯度≥99%）；

水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈（色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司）；甲醇（色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司）；磷酸（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；收集产自山东不同年限的金银花样品（江西百仁中药饮片有限公司，产地：山东。批号：200601）（湖南新汇制药股份有限公司，产地：山东。批号：151001），由长沙医学院吴沁璇讲师鉴定，均为药典所规定的忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 金银花的颜色测定

（1）测定条件。光源D65，视场10°，测量口径8 mm，测量时间约1 s，色差公式采用△E*ab，数据用L*、a*、b*进行表示。

（2）测定方法。将9批不同年限金银花样品进行颜色的分类，平铺于色差仪测试口，平均测量10次，取其平均值。

1.3.2 金银花活性成分含量测定

（1）色谱条件。WondaSil-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相：以乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)（10:90）；流速：1 mL/min；柱温：25℃；检测波长：284 nm；进样量：10μL。

（2）对照品溶液制备。精密称取绿原酸对照品10 mg于25 ml容量瓶，加入50%甲醇溶解定容，得400μg/ml绿原酸对照品溶液；精密称取5-羟甲基糠醛对照品3.73 mg于10 ml容量瓶，加入50%甲醇溶解定容，得373μg/ml5-羟甲基糠醛对照品溶液。

（3）供试品溶液制备。粉碎金银花后过4号筛，称取金银花的粉末1.0 g于具塞锥形瓶，精密加入50%甲醇25 ml，称定质量，超声处理30 min，放冷，用50%的甲醇补足减失的重量，摇匀过滤，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

（4）线性关系的考察。精密量取绿原酸对照品溶液3 ml、2.5 ml、2 ml、1.5 ml、1 ml、0.5 ml，精密量取5-羟甲基糠醛对照品溶液1.5 ml、1 ml、0.5 ml、0.25 ml、0.1 ml、0.05 ml，各置于10 ml棕色容量瓶制备成混合对照品溶液，按照色谱条件检测，以混合对照品溶液浓度（μg/ml）为横坐标（X），将峰面积做（Y）进行线性回归。得出绿原酸回归方程为Y=18.03X+15.221，R²=0.981 5；5-羟甲基糠醛Y=80.65X-65.015，R²=0.9962。表明绿原酸在20～120μg/ml范围内线性关系良好，5-羟甲基糠醛在1.865～55.95μg/ml范围内线性关系良好。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substance(A)and test substance(B)

2 结果与分析

2.1 金银花的颜色

金银花颜色测量值见表1所示。结果显示，L*值从棕褐色开始逐渐升高，a*值总体上从棕褐色开始逐渐降低，b*值无明显变化趋势，储存年限越长，金银花颜色越趋于棕褐色。

表1 不同年限金银花颜色测量值Table 1 Color measurement values of Lonicera japonica Thunb of different years

2.2 金银花5-羟甲基糠醛与绿原酸含量

将制备好的供试品溶液，按照色谱条件下进样测定，记录峰面积，采用外标法计算金银花样品中活性成分的含量，结果见表2。结果大致显示颜色偏棕黄的金银花绿原酸含量低，5-羟甲基糠醛含量高。

表2 含量测定结果Table 2 Content determination results

2.3 相关性分析

2.3.1 金银花成分含量与颜色值相关性分析

将金银花中5-羟甲基糠醛、绿原酸的含量分别与颜色值L*、a*、b*用SPSS20.0软件做相关性分析，结果见表3。

表3 金银花有效成分与色度值相关系数（n=9）Table 3 Correlation coefficient between active components and chromaticity value of Lonicera japonica Thunb(n=9)

由表3所示，金银花中5-羟甲基糠醛与绿原酸均与明度L*存在相关性，具有显著影响。5-羟甲基糠醛与L*的双尾检验的概率为0.016（P＜0.05），相关系数为-0.769，说明5-羟甲基糠醛与L*呈负相关；绿原酸与L*的双尾检验的概率为0.018（P＜0.05），相关系数为0.757，说明绿原酸与L*呈正相关；而这两成分与a*、b*值均无相关性（P>0.05）。

2.3.2 金银花颜色值与有效成分回归分析

将金银花中5-羟甲基糠醛、绿原酸的含量为自变量与颜色值L*、a*、b*分别为因变量用SPSS 20.0软件做回归分析。

由表4可知，L*与5-羟甲基糠醛、绿原酸的R2为0.638，说明明度L*有63.8%的程度与这2个有效成分的含量存在影响。由表5方差分析可知，P=0.047<0.05，所以2个有效成分构成的回归式统计上是显著的。根据表6得知，该回归方程为：

表4 L*与5-羟甲基糠醛、绿原酸模型汇总Table 4 L*and The summarization of 5-HMF and chlorogenic acid models

表5 L*与5-羟甲基糠醛、绿原酸方差分析Table 5 L*and variance analysis of 5-HMF and chlorogenic acid

表6 L*与5-羟甲基糠醛、绿原酸回归系数Table 6 L*and regression coefficient of 5-HMF and chlorogenic acid

具有统计学意义。由于以a*、b*为因变量时进行回归分析发现不显著，不具有统计学意义，故省略。

3 结论与讨论

3.1 结论

本实验通过测定9批年限不同的金银花中的绿原酸、5-羟甲基糠醛的含量及颜色L*、a*、b*值，将活性成分的含量与颜色值做相关分析，发现金银花中绿原酸的含量与L*呈正相关，5-羟甲基糠醛的含量与L*呈负相关，说明在金银花样品中，L*值越大则绿原酸含量越高，5-羟甲基糠醛含量越低。同时发现色泽偏棕颜色较深的金银花中5-羟甲基糠醛的含量越大，说明5-羟甲基糠醛对颜色也存在一定影响。

本实验将金银花中5-羟甲基糠醛、绿原酸的含量分别为因变量、以颜色值L*、a*、b*自变量，做回归分析，结果都不显著，故省略；以2个有效成分与L*为因变量做出的回归分析，得出了具有统计学意义的回归方程，该方程可以通过一个色度值推测金银花中有效成分的含量，为以后的金银花质量控制提供了一种新方案，为金银花的质量评价提供了参考依据。

3.2 讨论

实验发现，除了HPLC测定出的绿原酸、5-羟甲基糠醛含量与色度存在变化关系外，同时发现不同色度的金银花中也有其他物质的峰面积存在一定变化，可能对色度也存在一定影响，在后续的实验中，应该予以关注。

市场存在金银花和山银花相互掺假的现象，导致市场混乱。这两种药材都是忍冬科植物，在形态成分、药理作用等等具有极其相似的作用。因此，可以考虑对山银花进行高效液相色谱法的5-羟甲基糠醛及其他活性成分含量测定，并分析其与色度值的相关性，评判该方法对鉴别金银花和山银花是否存在价值。

5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸性等条件下脱水生成的具有呋喃环结构的醛类化合物，是麦拉德反应的典型产物之一［8］，具有一定的神经毒性、致癌性［9］。最近发现5-羟甲基糠醛与中药材的色泽程度存在一定的相关性，色泽程度越深的药材，5-羟甲基糠醛的含量大多偏高［10-11］。中药中5-羟甲基糠醛药理、毒理作用的研究较多，但其与金银花颜色相关性的研究较少，还未将其纳入药材的控制指标。从本实验数据来看，可初步认定5-羟甲基糠醛对色度有影响，但是要建立一套控制中药材质量的方法，实现中药材药效成分含量的快速检测，还需通过进一步的实验验证。