四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块胶原和血管重构的影响

樊钦华，金 荣，杜雅薇，吴圣贤

动脉粥样硬化为脑卒中、心绞痛等多种血管性疾病发生的基础因素，本质是慢性炎症性反应过程[1]，斑块结构不稳定或破裂继发栓塞严重者危及生命。四妙勇安汤是治疗热毒壅盛型脉管炎的经典名方，具有清热活血的功效，近年来逐渐拓展用于诊治心脑血管疾病。细胞外基质为斑块纤维帽的主体结构组成，是影响斑块结构稳定的关键部分，骨架以血管平滑肌细胞合成的胶原为主[2]。胶原表达直接决定纤维帽厚薄程度，其表达减少影响斑块内部构成，导致斑块纤维帽厚度减小。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)具有抗炎、抑制脂肪条纹病变、防止动脉粥样硬化发展、调节血管细胞功能的作用[3]，是细胞外基质，特别是Ⅰ型/Ⅲ型胶原合成的主要调节因子[4]。经过血管内皮损伤、小血管新生、纤维帽变薄、血管病理性重构等环节后破坏斑块内部稳定结构，导致易破损斑块形成。课题组前期研究显示，四妙勇安汤治疗动脉粥样硬化疗效确切[5-6]，可有效减轻血管炎症反应，抑制动脉粥样硬化进展，且安全性高[7]。本研究通过制载脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠主动脉粥样硬化动物模型，观察四妙勇安汤对模型小鼠主动脉粥样硬化斑块胶原和血管重构的影响，进一步探讨其对稳定斑块的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级7～8周龄雄性ApoE-/-小鼠35只及同品系C57BL/6J小鼠10只，体质量20～25 g，购自北京大学医学部实验动物中心。实验室室温22～24 ℃，相对湿度50%，光照时间07：00～19：00。

1.2 实验药物 辛伐他汀(商品名舒降之，默沙东公司生产，批号：20080224)。四妙勇安汤免煎颗粒(含金银花免煎颗粒、玄参免煎颗粒、当归免煎颗粒、生甘草免煎颗粒，批号分别为：20081225、20090112、20090218、20081129)，由北京中医药大学东直门医院提供。

1.3 实验试剂及仪器 兔抗鼠平滑肌细胞α肌动蛋白(SMα-actin)，购自武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1025 ；二步法免疫组化检测试剂(羊抗兔/鼠IgG抗体-HRP多聚体)，货号：ZB1901，浓缩型DAB显色试剂盒，均购自北京中衫生物技术有限公司；天狼星红(Siriued)，美国Sigma公司产，货号：G1360。旋转式组织脱水机(型号4634)、组织包埋机(型号5235)、石蜡溶蜡箱(型号PM-401)、切片机(型号CRM-440)均系日本SAKURA产品；美国Image-Pro Plus Version 6.0 (IPP6.0)图像分析软件。光学显微镜Olympus(型号BX51)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分组 高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠制备动脉粥样硬化模型。基础饲料喂养ApoE-/-小鼠7～8周，之后改高脂饲料喂养13周后随机处死5只，光镜下观察确认已形成基础动脉粥样硬化病变。其余30只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组和四妙勇安汤组，继续高脂饲料喂养19周。以同品系C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组，普通饮食饲养。

1.4.2 给药方法 按成人与小鼠给药剂量换算系数折算小鼠用药量。辛伐他汀、四妙勇安汤组蒸馏水溶解灌胃。模型组和正常对照组按体重比例采用生理盐水灌胃。各组小鼠每日给药，连续19周。

1.5 观察指标

1.5.1 取材 各组小鼠取材前夜禁食，次日按体重3.5%腹腔注射适量水合氯醛麻醉处死。无菌条件下取出心脏，4%多聚甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋。每只小鼠主动脉根部取4个切面：升主动脉最近端横截面、主动脉瓣起始横截面、主动脉瓣附着部位并有冠状动脉开口、主动脉瓣完全出现并有汇合倾向。切片厚5 μm，每隔100 μm连续取6张切片。

1.5.2 组织内胶原纤维类型及分布情况 采取天狼星红-苦味酸染色。切片常规脱蜡至水；0.1%饱和苦味酸天狼星溶液染色2 h，流水冲洗10 min；苏木素复染1～2 min，取出切片，流水冲洗10 min；最后脱水封片。光学显微镜采集图像，40倍和200倍镜下IPP 6.0图像分析软件测量各组小鼠主动斑块内胶原含量。

1.5.3 主动脉根部斑块内平滑肌细胞α肌动蛋白(SM-αactin)表达量 采取免疫组化二步法。SM-αactin一抗稀释浓度为1∶100，每组取1张磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行阴性对照。切片脱蜡至水，加入3%的H2O2，经室温孵育、PBS冲洗、微波修复，再滴加二抗(羊抗兔/鼠IgG抗体-HRP多聚体)，37 ℃培养箱孵育1 h，PBS冲洗3次，观察DAB显色。40倍和200倍镜下采用IPP 6.0图像分析软计算阳性面积占斑块面积比值，对斑块内SM-αactin表达量进行分析。

1.5.4 主动脉根部斑块内TGF-β1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达量 选取第3切面，采用Envision免疫组化二步法。TGF-β1、VEGF的抗体稀释度依次分别为1∶200与1∶200，每组均以PBS代替一抗作为阴性对照，每张切片分别选取左上、左下、下3个视野，100倍镜下采用IPP 6.0图像分析软件对阳性表达区域累积面积进行测定，计算斑块内各指标阳性区域面积占斑块面积的百分比。

2 结 果

2.1 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块胶原面积的影响 正常对照组主动脉根部未形成斑块，四妙勇安汤组斑块内胶原面积增加，辛伐他汀组斑块内胶原面积有一定程度增加。详见图1。与模型组比较，辛伐他汀组胶原面积增大，但差异无统计学意义(P>0.05)，而四妙勇安汤组斑块内胶原面积增大明显(P<0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠主动脉粥样斑块胶原面积比较(±s) 单位：%

图1 各组小鼠主动脉粥样斑块胶原面积天狼星红-苦味酸染色图(×40)

2.2 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠TGF-β1、VEGF表达阳性面积的影响 正常对照组主动脉根部无TGF-β1表达；与正常对照组比较，模型组斑块局部TGF-β1表达明显增加；与模型组比较，四妙勇安汤组TGF-β1表达明显升高(P<0.05)。正常对照组主动脉根部无VEGF表达；与正常对照组比较，模型组斑块局部VEGF表达升高。模型组与四妙勇安汤组VEGF表达阳性面积比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2、图3、表2。

表2 各组小鼠TGF-β1、VEGF表达阳性面积比较(±s) 单位：%

图2 各组小鼠主动脉根部斑块内TGF-β1表达量免疫组化染色图(×200)

图3 各组小鼠主动脉根部斑块内VEGF表达量免疫组化染色图(×200)

2.3 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉根部粥样斑块SM-αactin阳性面积的影响 正常对照组主动脉根部未形成斑块，动脉中膜无SM-αactin阳性表达颗粒，模型组和四妙勇安汤组小鼠动脉中膜和斑块纤维帽处可见SM-αactin阳性表达颗粒。详见图4。与模型组比较，四妙勇安汤组和辛伐他汀组SM-αactin表达阳性面积差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组小鼠主动脉根部斑块SM-αactin表达面积比较(±s) 单位：%

图4 各组小鼠主动脉根部斑块SM-αactin表达量免疫组化染色图(×200)

2.4 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠血管重构的影响 与模型组比较，辛伐他汀组和四妙勇安汤组血管内弹力膜面积和血管腔面积均呈减小趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组小鼠主动脉血管内外弹力膜面积和血管腔面积比较(±s) 单位：mm2

3 讨 论

在血管内皮损伤、脂肪条纹病变、炎症反应等多种因素相互作用下形成不稳定易破裂的动脉粥样硬化斑块，是诸多心脑血管系统病变急性发作的基础，纤维帽变薄、脆弱与血管重构是主要的病理特点。血管炎症反应在动脉粥样硬化复杂的病理过程中发挥着重要作用，白细胞和血管平滑肌细胞之间的平衡是维持斑块稳定的关键要素[8]。白细胞，尤其是巨噬细胞和T细胞聚集，是从正常血管壁结构向初期动脉粥样硬化转变的特征性标志[9]。炎症反应辨证属“热毒”范围，四妙勇安汤以金银花为君，并佐以玄参、当归、生甘草，促进血液循环同时可有效改善超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1、白细胞介素-6等炎症介质，具有较好的抗炎作用。

在病变血管中，以Ⅰ型TGF-β表达为主，TGF-β1可大量增加于细胞外基质。动脉粥样硬化病变过程中，脂肪刺激血管平滑肌细胞肥大、去分化，并增殖迁移至内膜，导致血管壁肥厚。模型组小鼠表现的低含量TGF-β1可能导致血管壁中白细胞聚集。TGF-β在体内具有一系列协同保护效应[3]，这种保护作用丧失可增加脂质病变沉积，导致稳定的富含细胞外基质的斑块表型转变为有破裂风险的不稳定的促炎斑块[10]。斑块内白细胞聚集增加，加之其余血管平滑肌细胞产生的细胞外基质减少，增加斑块破裂风险。TGF-β1通过下游信号Smad3可抑制基质金属蛋白酶表达，进而阻止细胞外基质降解[11]。核转录因子-κB是通过核转录因子κB抑制因子A(IκBα)的磷酸化被激活，再经丝裂原活化蛋白激酶刺激从而调节TGF-β/Smad信号转导[12]。课题组前期实验研究表明，四妙勇安汤可降低核转录因子-κB，增高核转录因子κB抑制因子A(IκBα)表达，还可抑制基质金属蛋白酶-9，降低模型小鼠总胆固醇、三酰甘油水平[6，13-14]。本研究结果显示，四妙勇安汤组斑块局部TGF-β1与胶原表达增加，进一步证实了四妙勇安汤是通过增加TGF-β1，抑制炎性细胞聚集，防止脂质损伤，并调控核转录因子-κB/IκBα/基质金属蛋白酶-9表达，引起纤维帽血管平滑肌细胞产生细胞外基质，抑制胶原分解，促进血管纤维化，进而维持正常的血管壁结构，稳定斑块。VEGF虽未见显著差异，相较于模型组高VEGF表达情况，说明四妙勇安汤具有减少VEGF趋势，提示四妙勇安汤可一定程度保护血管内皮细胞，抑制斑块内血管新生。

血管病理性重构是动脉粥样硬化的晚期特征，内外因素长期作用下刺激血管平滑肌细胞迁移，基质金属蛋白酶降解胶原纤维，细胞外基质代谢失衡重组，导致血管适应性动态重塑[15]，主要表现为管壁增生肥厚、血管弹力下降等管壁厚度、管径及血管形状改变，增加斑块破裂风险。血管病理性重构，具备中医“瘀血”特征。四妙勇安汤作为活血解毒代表方剂，《黄帝内经》记载：“疏其血气，令其调达”，概括了四妙勇安汤抗凝、改善血液循环、抗氧化、抑制血栓形成的功效。本研究中血管内外弹力膜面积与血管腔面积虽未表现出显著差异，但均明显缩小，作用强度与辛伐他汀相近，提示四妙勇安汤可一定程度上改善管腔狭窄，稳定血管结构，抑制血管重构。

破溃斑块属于动脉粥样硬化病变过程的“痰核毒化期”，此阶段的病机特点是热毒瘀血互结致损[16]，动脉粥样硬化与脉管炎皆是血管性病变，破溃斑块与热毒壅盛型脉管炎病机相近，与四妙勇安汤清热解毒活血的功效、方义相符。本研究结果显示，四妙勇安汤主要通过增加TGF-β1表达从而增加斑块内胶原含量。TGF-β受体的表达模式对已发生的血管壁改变具有锁定作用，即使TGF-β活动恢复正常，已分化的内膜血管平滑肌细胞通过产生细胞外基质而不是恢复至收缩状态来反映，因而，高含量TGF-β1表达可形成稳定的富含基质的动脉粥样硬化斑块[3]。

四妙勇安汤可抑制血管内弹力膜面积与血管腔面积增厚，防止病理性重构，有利于稳定血管结构。四妙勇安汤应用于改善动脉粥样硬化打破了传统观念认为其是脉管炎专方的看法，通过观察四妙勇安汤对斑块胶原和血管重构的影响，为临床治疗动脉粥样硬化、稳定动脉斑块进一步提供了动物实验依据，以期拓宽临床的治疗思路。