樟树花生根中提取白藜芦醇

施德锋，乐治平，马从莲，罗琪，姜峰

(南昌大学化学学院，江西 南昌 330031)

白藜芦醇，化学名为3，5，4’-三羟基二苯乙烯(3,5,4’-trihydroxystilbene)[1]，是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物[2]。越来越多的研究表明白藜芦醇具有抗心血管疾病、抗癌、抗氧化、抗炎、抗血小板凝集、降血脂、抗糖尿病、抗神经退行性疾病、抗乙醇诱导的遗传毒性等药理活性[3-5]。白藜芦醇已在许多植物中被发现，比如虎杖、花生、越橘属、葡萄和桑葚等[4,6-9]。

我国花生种植区域广泛，花生资源十分丰富。2019年,我国花生产量超过1 700万t，花生产量和单产位居世界第一，占世界花生总产量的39.2%[10-12]。江西樟树市是全国花生高产创建示范县、国家花生产业技术体系示范县，也是江西省三大花生主产区之一。2017年农业部批准对“樟树花生”实施农产品地理标志登记保护。

花生消费方式主要是榨油和食用[11]，但它的根和茎作为花生收获后的废弃物往往会被人们忽视。实际上，这些废弃物中含有许多对人体健康有益的天然活性化合物，如芪类、黄酮类等[13-14]。当前白藜芦醇的提取方法主要有超声法、微波法、酶法、超临界CO2萃取等，但还未有将酶、超声法和环糊精共同作用于提取白藜芦醇。因此，本文以乙醇为提取溶剂，同时辅以酶、β-环糊精，超声下提取樟树花生根中的白藜芦醇，进一步提高白藜芦醇提取率，以确定国家地理标志农产品的组成特性，并为花生废弃物的资源化利用提供参考依据。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

花生芽和花生植株(江西樟树吴城)；白藜芦醇标准品(99%，麦克林)；无水乙醇(西陇科技股份有限公司)；β-环状糊精(食品级，郑州食全食美食品有限公司)；纤维素酶(食品级，汇泉生物科技有限公司)；半纤维素酶(食品级，汇泉生物科技有限公司)；水为纯水。

UV-5500PC紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；高速多功能粉碎机(武义海纳电器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 原料制取

将样品用清水洗净于鼓风干燥箱中充分干燥。用粉碎机粉碎，过0.250 mm筛后，用密封袋将其保存在0～8 ℃环境中，备用。提取白藜芦醇前，要先用石油醚对其进行脱脂。

1.2.2 白藜芦醇标准曲线的绘制

将准确称取的25.2 mg白藜芦醇标准品用无水乙醇溶解并定容到250 mL容量瓶中,得到1.008 mg·mL-1标准品贮备液。分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL标准溶液置于10 mL容量瓶,用无水乙醇稀释到刻度线，摇匀,得系列标准溶液。以无水乙醇作参比,在最大吸收波长306 nm处测定其对应的吸光度,绘制标准曲线。

吸光度值A和白藜芦醇质量浓度C的关系曲线回归方程为:A=0.124 1C-0.018 6,相关系数R2=0.999 1。这表明白藜芦醇标样质量浓度与吸光度具有良好的线性关系。

1.2.3 超声波法辅助提取法白藜芦醇[15-16]

称取一定量的石油醚脱脂后的花生样品粉末，先分别考察花生各组分中的白藜芦醇含量，确定白藜芦醇含量最大组分，再按单因素实验分别考察超声功率(20，40，60，80，100 W)、超声时间(20，30，40，50，60，70，80 min)、料液比(1:20，1:30，1:40，1:50 g·mL-1)、乙醇体积分数(60%，65%，70%，75%，80%)、超声温度(30，40，50，60，70 ℃)等对提取率的影响。提取完毕后，离心，从上清液中取0.2 mL样液于10 mL容量瓶用无水乙醇定容，并以无水乙醇为参比，在波长306 nm处测定吸光度，计算提取率。图1为白藜芦醇测定的标准曲线。

白藜芦醇质量浓度/(μg·mL-1)图1 白藜芦醇测定标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of resveratrol

1.2.4 超声波-酶法辅助提取白藜芦醇[17]

称取一定量的石油醚脱脂后的花生样品粉末，按单因素实验分别按酶添加量(1%，2%，3%，4%，5%)、酶种类(纤维素酶、半纤维素酶)、酶配比对花生样品进行酶解，在35 ℃水浴中酶解60 min。酶解后，加入乙醇溶液，在超声波法辅助提取白藜芦醇的最优条件下，进行超声波提取。提取完毕后，按1.2.3中的方法来测定并计算提取率。

1.2.5 超声波-β-环状糊精法辅助提取白藜芦醇[15]

称取一定量的石油醚脱脂后的花生样品粉末，在超声波法辅助提取白藜芦醇的条件下，考察β-环状糊精用量(1:0.015，1:0.030，1:0.045，1:0.060，1:0.075，1:0.090，1:0.105 g·mmol-1)对提取率的影响，分别量取0，0.5，1.0，1.5，2，2.5，3.0，3.5 mL β-环状糊精溶液(0.01 mol·L-1)进行实验。

1.2.6 超声波-β-环状糊精-酶法辅助提取白藜芦醇

称取一定量的石油醚脱脂后的花生样品粉末，在超声波法辅助提取白藜芦醇的最优条件、酶最佳配比和添加量以及β-环状糊精(0.01 mol·L-1)最佳用量下，完成对花生样品的提取。提取完毕后，按1.2.3中的方法测定并计算提取率。

2 结果与讨论

2.1 花生各组分中白藜芦醇含量影响

在样品0.33 g、超声温度60 ℃、超声功率80 W、超声时间50 min、料液比1:60 g·mL-1、70%乙醇体积分数的条件下，探知花生芽不同生长长度的芽茎(芽1(0～2 cm)、芽2(2～4 cm)、芽3(4～6 cm))、芽根、红衣和花生植株各组分中白藜芦醇的含量。

组分类别图2 花生各组分中的白藜芦醇含量Fig.2 Resveratrol content in peanut buds and peanut plants

可以看出，花生芽的根部白藜芦醇含量最高，其次是花生植株的根部中白藜芦醇的含量。从图中还可以看出，芽1、芽2和芽3中白藜芦醇提取率接近，说明花生芽茎的生长长度对白藜芦醇含量的影响不大，花生果肉外层的红衣、花生植株的茎和叶中含有的白藜芦醇都较低。在工业实际生产中，考虑到原料的获取，选择花生植株的根部作为白藜芦醇的主要获取来源比较合理。

2.2 超声功率对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

在花生根0.4 g、超声温度60 ℃、超声时间60 min、料液比1:50 g·mL-1、70%乙醇体积分数的条件下，研究超声功率对花生根中白藜芦醇提取率的影响，结果见图3。

超声波能够破坏植物细胞，并促进细胞内容物释放到提取介质中，并且细胞破碎显著增加了接触面积，加速了目标提取物向提取溶剂的传质速率。当声波功率增大时，声强会变大，空化气泡的半径与起始半径会变大，空化强度增强，即声强越高，空化越强，从20 W上升到80 W过程中，白藜芦醇的提取率逐渐增大，80 W时，提取率达到最大。但并不是功率越大，超声提取效果越好，在80 W后，超声对白藜芦醇的提取率迅速下降，这可能是由于空化气泡破裂产生的局部高压和高温导致白藜芦醇的降解[18]。

超声功率/W图3 超声功率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power

2.3 超声时间对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

在花生根0.4 g、超声功率100 W、超声温度60 ℃、料液比1:50 g·mL-1、70%乙醇体积分数的条件下，研究超声时间对花生根中白藜芦醇提取率的影响，结果如图4。

超声时间/min图4 超声时间的影响Fig.4 Effect of ultrasound time

白藜芦醇的提取率随着超声波作用时间延长呈先增长后降低的变化规律。当功率一定时，随着超声波提取时间的延长，白藜芦醇的提取率也在逐渐增加。当超声时间达到50 min时，提取率达到最大；再增加时长，白藜芦醇提取率开始降低，这可能是由于超声时间过长，已溶出的白藜芦醇部分降解[18]。因此，实验应控制超声时间在50 min。

2.4 乙醇体积分数对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

提取白藜芦醇的常用溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等，现在还出现了绿色溶剂[19]，但考虑到提取溶剂应具有安全无毒、低价易回收、获取便捷等特点，最终选择了乙醇作为提取白藜芦醇的试剂。查阅文献获知60%～90%乙醇水溶液对白藜芦醇的提取较为常用。因此，在花生根0.4 g、超声功率100 W、超声时间60 min、超声温度60 ℃、料液比1:50(g·mL-1)的条件下，研究乙醇体积分数对花生根中白藜芦醇提取率的影响。

从图5可以看出，在60%～70%乙醇对白藜芦醇提取率逐渐增大，70%乙醇体积分数对花生根中的白藜芦醇提取效果最佳；继续增大乙醇体积分数，白藜芦醇提取率迅速降低后，渐趋于平缓。这是由于乙醇体积分数变化，溶剂极性随之变化，花生根中的其他醇溶性物质也随乙醇体积分数的变化而溶出，与白藜芦醇形成了竞争关系，白藜芦醇提取率因此呈现出先升高后下降的趋势[20]。

乙醇体积分数/%图5 乙醇体积分数的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration

2.5 超声温度对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

在花生根0.4 g、超声功率100 W、超声时间60 min、料液比1:50(g·mL-1)、70%乙醇体积分数的条件下，研究超声温度对花生根中白藜芦醇提取率的影响。

从图6可知，超声提取1 h，白藜芦醇的提取率随温度的升高而不断增大。但是考虑到花生根中白藜芦醇的提取率，乙醇的挥发性，超声清洗机难以达到并稳定在70 ℃等因素，最终选择60 ℃作为提取白藜芦醇的提取温度。

超声温度/℃图6 超声温度的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature

2.6 料液比对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

在花生根0.4 g、超声功率100 W、超声时间60 min、超声温度60 ℃、70%乙醇体积分数的条件下，研究料液比对花生根中白藜芦醇提取率的影响。

由图7可知，当料液比从1:10(g·mL-1)增加到1:70(g·mL-1)，白藜芦醇的提取率也一直在增大；在超过1:60(g·mL-1)后，提取率增大有变缓的趋势。考虑到实际生产成本和提取率，选择1:60(g·mL-1)作为提取白藜芦醇的料液比。

液料比/(mL·g-1)图7 料液比的影响Fig.7 Effect of material-to-liquid ratio

2.7 β-环糊精用量对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

如图8所示，在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超声功率100 W、超声时间60 min、超声温度60 ℃、70%乙醇体积分数的条件下，研究β-环状糊精用量对花生根中白藜芦醇提取率的影响。

β-五糊精用量/mL图8 β-环糊精用量的影响Fig.8 Effect of β-cyclodextrin dosage

可知，β-环糊精(0.01 mol·L-1)的添加明显影响到花生根中白藜芦醇的提取率，这可能是由于白藜芦醇溶出后被β-环状糊精包合，从而进一步促进了花生根中残余白藜芦醇的溶出。在环糊精添加量逐渐增加到2.5 mL时，即β-环状糊精用量比例增大至1:0.075(g·mmol-1)，白藜芦醇的提取率达到最大；继续增大添加量时，提取效果逐渐变差。这是由于花生根中含有丰富的多酚类物质也会与环糊精包合，从而影响到白藜芦醇的包合溶出；再继续加大环糊精的用量后，由于环糊精在乙醇水溶液中的溶解度有限，白藜芦醇的提取率趋于平稳[21-22]。因此，选择花生根用量与β-环状糊精用量1:0.075(g·mmol-1)的比例来辅助提取白藜芦醇。

2.8 酶配比对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超声功率80 W、超声时间60 min、超声温度60 ℃、70%乙醇体积分数的条件下，研究酶配比对花生根中白藜芦醇提取率的影响。

纤维素酶和半纤维素酶能作用于细胞的细胞壁，使构成植物细胞壁的多糖类水解，从而方便细胞内物质溶出[23]。由图9可知，纤维素酶单独作用的效果优于半纤维素酶，也优于两种酶共同作用的效果。

m(纤维素酶)：m(半纤维素酶)图9 酶配比的影响Fig.9 Effect of enzyme ratio

2.9 酶添加量对提取花生根中白藜芦醇含量的影响

在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超声功率80 W、超声时间60 min、超声温度60 ℃、70%乙醇体积分数的条件下，研究酶添加量对花生根中白藜芦醇提取率的影响。

由图10可知，在纤维素酶添加量由1%增大到2%时，白藜芦醇的提取率增大并达到最大，提取率为0.52%，继续增加纤维素酶的用量，作用效果迅速下降后逐渐趋于稳定。这可能是因为酶添加量达到一定量后，其底物浓度相对不能饱和，酶作用效果从而减弱。

酶添加量/%图10 酶添加量的影响Fig.10 Effect of enzyme addition

2.10 不同提取方法对提取花生根中白藜芦醇含量的效果比较

为筛选出更为合理的提取方法，在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超声功率80 W、超声时间50 min、超声温度60 ℃、70%乙醇体积分数下，比较分别单独使用2%纤维素酶和25 mLβ-环状糊精(0.1 mol·L-1)，即β-环状糊精用量1:0.075(g·mmol-1)及联合使用两者的条件下，对花生根中提取白藜芦醇的影响，结果列于图11。

酶添加量/%图11 不同提取方法提取白藜芦醇Fig.11 Different extraction methods to extract resveratrol

由图11可知，β-环状糊精和纤维素酶形成了较好的协同作用，互相促进了各自作用效果，使得β-环糊精和纤维素酶协同作用下的效果优于单独使用纤维素酶或β-环状糊精的效果，其中单独使用纤维素酶提取白藜芦醇的效果在这3种方法中最差。

3 结论

以国家地理标志农产品——樟树花生为对象，测定其相关组分中白藜芦醇的含量。通过单因素实验研究超声功率、超声时间、超声温度、乙醇体积分数、料液比等因素对花生根中提取白藜芦醇的影响，并优化了工艺条件。发现采用超声波-β-环状糊精-酶法辅助提取白藜芦醇，在2%纤维素酶、β-环状糊精用量1:0.075(g·mmol-1)、70%乙醇、料液比1:60(g·mL-1)、超声温度60 ℃、超声时间50 min、超声功率80 W的最佳工艺条件下，白藜芦醇的提取率为0.587%。