酒花内生菌Pseudomonas oryzihabitans F0-1转化柠檬烯生成α-萜品醇的研究

廉长盛，付冬梅，张俊鹏，张逸凡，薛兆茹，王 越

（大连工业大学生物催化技术国家与地方联合工程实验室，辽宁 大连 116034）

柠檬烯又名苧烯，是一种重要的功能性单萜，已被发现存在于300 多种植物中。柠檬烯是柑橘类水果加工的副产物，在橙皮精油中含量高达90%～95%。因其价廉易得，且化学性质活泼，被用作合成萜烯衍生物的前体，这些衍生物在食品、医药和精细化工行业中应用广泛[1-2]。

柠檬烯可以转化为含氧单萜化合物，相比于萜烯类化合物，含氧单萜具有更强的香气，且自然资源中含量少。如α-萜品醇，它是一种单萜类化合物，其在香料行业中的商业价值较高，消耗量约为每年9.2 t。α-萜品醇具有紫丁香的花香气味，在香水、化妆品和洗漱用品中通常用作香料[3-4]。由于其抗菌和抗氧化特性，在制药工业中也被用作抗真菌剂和消毒剂产品[3,5-6]，并在食品工业中用作防腐剂，可用于调配柠檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精[7-9]。

研究发现，真菌和细菌能在有氧条件下对柠檬烯进行生物转化。Tai 等[10]利用Penicillium sp 转化柠檬烯，产物主要是α-萜品醇和少量的香芹酮和香芹醇；Rottava 等[11]从400 种微生物中筛选出能转化柠檬烯生成α-萜品醇的黑曲霉；Bicas 等[12]通过荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens 转化柠檬烯生成α-萜品醇。相比化学合成，微生物转化反应因操作简单、条件温和、高效率和高选择性、无毒、对环境友好，显示出广阔的基础理论研究和应用前景[13]。目前天然来源的化合物比化学合成的化合物具有更高的市场价值，因此，通过生物转化获得天然香料具有很高的市场研发价值[14-15]。

啤酒花是大麻科葎草属多年生攀援草本植物，是一种重要的香料和药用植物[16-18]，其挥发成分酒花油中含有70%的萜烯化合物，包括单体萜烯如α-蒎烯和香叶烯，倍半萜烯如β-石竹烯和α-葎草烯等[19]。而酒花内生菌长期伴随植物生长，参与宿主的生长代谢，很可能会具备与宿主植株相似次生代谢的潜能[20-21]。因此，开发植物内生菌资源，将会为天然产物的合成提供新方案。本研究从酒花内生菌入手，筛选具有柠檬烯转化潜力的菌种，进行生理生化和分子鉴定，并优化生物转化条件，以提高酒花内生菌转化柠檬烯的转化率。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

野生新鲜酒花雌花果，摘自河北省秦皇岛；α-萜品醇标准品（＞99%），内标物萜品烯-4-醇（＞99%），阿拉丁试剂有限公司；柠檬烯（＞95%），北京百灵威科技有限公司；次氯酸钠，乙酸乙酯（≥95%），乙醇（≥95%），甲醇（≥95%）和甘油（≥95%），科密欧化学试剂有限公司；琼脂粉、胰蛋白胨、大豆粉和植物蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司；NaCl、K2HPO4等分析纯，天津市大茂化学试剂厂；甘露醇，沈阳市试剂二厂。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 分离培养基

水琼脂培养基（WA）：琼脂粉18 g/L，pH 7.2±0.2。

酵母提取物琼脂培养基（TWYE）：酵母提取物0.25 g/L，K2HPO40.5 g/L，琼脂粉18 g/L，pH 7.2±0.2。

甘露醇大豆琼脂培养基（MS）：甘露醇20 g/L，大豆粉20 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.2±0.2。

大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）：胰蛋白胨15 g/L，植物蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉15 g/L，pH 7.3±0.2。

1.1.2.2 复筛培养基

甲醇0.1 g/L，(R)-(+)-柠檬烯4.5 g/L，NaNO33.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO40.01 g/L和琼脂20 g/L。

1.1.2.3 LB 培养基

胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L。

1.1.2.4 细菌基本培养基

葡萄糖5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，柠檬酸钠1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L。

1.1.2.5 营养培养基（NA）

牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

1.1.3 仪器与设备

GC9790Plus 气相色谱仪，浙江福立分析仪器股份有限公司；7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪，配EI 离子源，美国Agilent 公司；DB-FFAP 毛细管色谱柱，中科院大连化物所；SPME 专用磁力加热搅拌器，SPME-GC PK 1 固相微萃取手柄，北京康林科技有限责任公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）萃取头，美国Supelco 公司；ZQZY78CNT 型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种的筛选及鉴定

1.2.1.1 菌种的筛选

先将新鲜酒花用流水冲洗，晾干，分别剪成根、茎、叶、花等部分。用75%酒精浸泡3 min，无菌水冲洗3次；用10%次氯酸钠浸泡5 min，无菌水冲洗3 次。在无菌条件下，分别将消毒处理的酒花花茎、花轴、苞叶和花朵（包含蛇麻腺）部位切成1 cm×1 cm 的小块，均匀置于分离培养基上，37 ℃培养。

将4 种分离培养基分离获得的菌株转接至LB琼脂培养基，培养24 h，划线纯化菌株。采用感官评定法对产香内生细菌进行闻香筛选。

将菌株经过液体LB 培养基活化，按照5%接种量接入到复筛培养基中（250 mL 具塞磨口瓶），30 ℃，200 r/min 条件下恒温振荡培养。转化72 h，利用固相微萃取-气相色谱-质谱连用（SPME-GC-MS）检测转化产物。

1.2.1.2 菌种的鉴定

形态学特征初步鉴定：对菌落形态特征、颜色、大小、革兰氏染色等进行观察。生理生化试验鉴定参照文献[22]。

分子生物学鉴定：提取筛选菌株的DNA 进行16S rDNA PCR 扩增。利用16S rDNA 的1492R 和27F通用引物进行PCR 扩增。测序由吉林省库美生物技术有限公司完成。测序结果在GenBank 数据库系统中进行基本局部比对，采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

1.2.2 萜烯物质SPME-GC-MS 分析方法

固相萃取条件：将发酵液在4 ℃，8 000 r/min 条件下离心10 min，吸取5 mL 上清液移入固相萃取样品瓶中。加入2 g NaCl 促进样品挥发，将样品瓶放在固相萃取仪上，温度60 ℃，转速160 r/min。推出SPME 萃取头的纤维，吸附30 min 后，插入GC 进样口解析5 min。

气相色谱条件：色谱柱为DB-FFAP 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm），载气为氮气；升温程序为：柱初温45 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升温至120 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min 升温至250 ℃，保持10 min。分流比为5∶1。

质谱条件：离子源温度220 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描范围（m/z）100～420。

定量分析：采用内标法进行定量，α-萜品醇标准曲线如下：

y=0.635 6x+0.201 2，R2=0.997 4

式中：x 为α-萜品醇与内标浓度比；y 为α-萜品醇与内标面积比。

1.2.3 生长时期及转化时间的筛选

为了考察细菌培养基对Pseudomonasoryzihabitans F0-1 菌株在不同生长期转化柠檬烯生成α-萜品醇的影响，将菌株分别接种到NA 培养基和细菌基本培养基中，定时测定菌液在波长为600 nm 下的光密度值，以OD 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株在NA 和细菌基本培养基中的生长曲线。

根据测得的生长曲线，在30 ℃，200 r/min 转化培养基中培养内生菌F0-1，分别在各生长时期加入柠檬烯，定时取样。按照“1.2.2”中的方法检测α-萜品醇浓度，考察不同生长时期及转化时间对内生菌F0-1转化柠檬烯生成α-萜品醇的影响。

1.2.4 共溶剂种类的筛选

为考察共溶剂对F0-1 菌生物转化的影响，分别配制20%的(R)-(+)-柠檬烯/共溶剂混合溶液。将混合溶液添加到在NA 培养基中培养38 h 的F0-1 菌液内，培养条件为30 ℃，200 r/min，共溶剂分别为乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甘油。转化12 h，检测α-萜品醇浓度，对照为不加共溶剂。

1.2.5 底物浓度的筛选

为了考察F0-1 转化柠檬烯的最适浓度，将F0-1菌培养24 h 后，分别加入440、880、1 760、3 520 mg/L R-(+)-柠檬烯，生物转化12 h 后，测定α-萜品醇浓度，筛选适宜的底物浓度。

1.2.6 转化条件的筛选

1.2.6.1 转化温度

为考察温度对F0-1 转化的影响，采用不同转化温度（10、20、30、40 ℃），菌种在200 r/min 预培养38 h后，加入20%的(R)-(+)-柠檬烯/乙醇混合溶液，转化12 h 后，检测α-萜品醇浓度，筛选适宜的转化温度。

1.2.6.2 pH

为考察转化体系中pH 值对F0-1 转化柠檬烯生成α-萜品醇的影响，用0.05 mol/L 的柠檬酸磷酸缓冲液调节转化培养基pH 为3.0～8.0。菌种在30 ℃，200 r/min 预培养38 h 后，加入20%的(R)-(+)-柠檬烯/乙醇混合溶液，转化12 h 后，检测α-萜品醇浓度，筛选适宜的pH。

1.2.6.3 转速

为考察转速对生物转化的影响，将F0-1 菌种在30 ℃，200 r/min，pH 6.0 条件下预培养38 h 后，加入20%的(R)-(+)-柠檬烯/乙醇混合溶液。分别采用0、100、200、300 r/min 进行转化，转化12 h 后，检测α-萜品醇浓度，确定最佳的转速。

1.2.7 数据处理

使用Execl 软件处理数据，使用MEGA 7.0 构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选及鉴定

2.1.1 酒花内生菌的筛选

将消毒处理过的酒花的花茎、花轴、苞叶和花朵（包含蛇麻腺）部位分别在4 种分离培养基（WA、TWYE、MS、TSA）中恒温培养，共分离出22 株产香内生细菌，其中通过WA 培养基分离出2 株细菌；通过TWYE 培养基分离出14 株细菌；通过MS 培养基分离出6 株细菌；通过TSA 培养基没有分离出微生物。

经过复筛培养基筛选和SPME-GC-MS 分析，F0-1和F0-2 两株菌均可以转化柠檬烯生成含氧单萜化合物。菌种F0-1 能转化柠檬烯生成香芹酮、香芹醇和α-萜品醇，生成的α-萜品醇浓度为（9.24±1.67）mg/L。菌种F0-2 能转化柠檬烯生成香芹酮和α-萜品醇，生成的α-萜品醇浓度为（2.04±1.11）mg/L。两种菌都能转化柠檬烯生成α-萜品醇，且F0-1 菌生成的α-萜品醇浓度是F0-2 菌的4.5 倍，因此选定F0-1 为转化柠檬烯合成α-萜品醇的菌株，并对F0-1 进行菌种鉴定。

2.1.2 内生菌F0-1 菌种的鉴定

细菌在LB 培养基37 ℃下培养24 h 后观察菌落的形态，可以看到菌落黄色，圆形，凸起，干燥皱起，边缘整齐。显微镜下观察革兰氏染色结果为阴性，F0-1菌生理生化结果见表1，系统发育树见图1。

表1 F0-1 菌生理生化试验结果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of F0-1 strain

图1 内生菌F0-1 的16S rDNA 系统发育树Fig.1 16S rDNA system development tree of F0-1 bacteria strain

F0-1 与NCBI 核酸数据库进行同源性菌的16S rRNA 基因序列比对，与Pseudomonas oryzihabitans 相似性达99.99%。结合菌株F0-1 的生理生化结果、菌落形态特征及16S rDNA 分析，鉴定菌株F0-1 为栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。

2.2 不同生长时期及转化时间对α-萜品醇产量的影响

培养基的营养成分和浓度对微生物生长和转化柠檬烯合成α-萜品醇有不同影响[23]。由图2 可知，F0-1 在细菌基本培养基中进入对数生长期、稳定期和衰亡期的时间分别是6 h、22 h 和46 h；在NA 培养基中F0-1 的生长周期更短一些，进入对数生长期、稳定期和衰亡期的时间分别是2 h、10 h 和38 h。

图2 F0-1 菌在两种培养基中的生长曲线Fig.2 Growth curves of F0-1 bacteria strain in two culture media

由图3 可见，两种培养基都是在衰亡期合成α-萜品醇浓度高于对数期和稳定期，且NA 培养基产量更高，在衰亡期转化12 h 合成α-萜品醇最高，为38.7 mg/L；细菌基本培养基中的最高产量在衰亡期转化24 h 处获得，为28.6 mg/L。台亚楠[24]在优化指状青霉DSM 62840 转化柠檬烯条件时，发现对数期添加柠檬烯能获得最大产量。菌种不同，最适底物添加时期也不同，细菌Pseudomonas gladioli 和指状青霉不同，其最适底物添加时期为对数晚期至稳定期，此时的菌量较高[25]。而F0-1 菌衰亡期α-萜品醇生成量高的原因可能是由于这时体系中碳源消耗过大，此时添加柠檬烯作为新的碳源，被菌种利用。也可能是细胞衰亡裂解，胞内的酶更容易和底物接触。对比两种培养基，NA 培养基的转化量较高，且最高转化量在添加底物后的12 h，转化时间短，效率高。因此，最优条件为将F0-1 菌接种到NA 培养基中，在衰亡期（培养38 h）添加柠檬烯，转化12 h。

图3 不同生长时期及转化时间对α-萜品醇产量的影响Fig.3 Effects of different growth stages and conversion time on the α-terpineol production

2.3 共溶剂种类对柠檬烯生物转化的影响

柠檬烯难溶于水相，溶解度仅为0.015 mmol/L，化学稳定性差，易发生自动氧化[26]。用共溶剂可以增加柠檬烯的溶解度，从而提高产物浓度[27]。由图4 可知，共溶剂促进作用从大到小依次为乙醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞甘油。添加乙醇为共溶剂，α-萜品醇浓度比对照组提高48.5%，极性有机溶剂可以提高柠檬烯等萜烯物质的溶解度，在生物转化中形成单向系统，加快反应速度，一般会促进产物生成[28]。因此甲醇和乙醇对生物转化均有促进作用；与空白对照相比，甘油使α-萜品醇浓度降低3.14 mg/L，在4 种共溶剂中，甘油对F0-1 的生物转化影响并不显著。非极性有机溶剂乙酸乙酯对生物转化也有一定的促进作用，α-萜品醇浓度提高了9.1%。考虑到乙醇价格低，可用于食品添加剂的萃取，且对柠檬烯生物转化的促进作用明显，因此选择乙醇作为生物转化的共溶剂。

图4 共溶剂对柠檬烯生物转化的影响Fig.4 Effects of cosolvent on biotransformation of limonene

2.4 底物浓度对萜品醇产量的影响

研究表明，高浓度的萜烯物质对微生物细胞有毒害作用[29]，这也是微生物转化单萜生成含氧衍生物的难点之一，单萜浓度过高会影响微生物转化能力并抑制微生物的生长[28]。由图5 可知，柠檬烯转化的最适浓度为880 mg/L，当高于880 mg/L 时，产量下降。Gloria等[23]用指状青霉DSM62840 转化柠檬烯时，当柠檬烯浓度过高时会影响转化的选择性，生成其他含氧衍生物。因此，选择880 mg/L 的柠檬烯作为F0-1 转化的最适浓度。

图5 柠檬烯浓度对α-萜品醇产量的影响Fig.5 Effects of limonene concentrations on the α-terpineol production

2.5 转化条件对α-萜品醇合成的影响

2.5.1 温度对α-萜品醇产量的影响

柠檬烯生物转化效率与温度相关[25]。由图6 可知，培养温度对α-萜品醇产量有较大的影响，30 ℃时产量最高。从10～30 ℃，转化量逐渐上升，转化温度40 ℃时产量大幅下降，可能是高温影响了转化酶活力，并且高温也不适合微生物生长。

图6 培养温度对α-萜品醇产量的影响Fig.6 Effects of culture temperatures on the α-terpineol production

2.5.2 pH 对α-萜品醇产量的影响

由于在pH 为3.0 和4.0 时，F0-1 菌无法生长，故不在图7 中体现。由图7 可见，pH 为6.0 时α-萜品醇产量最高。当pH 大于7.0 时，α-萜品醇浓度下降。有研究报道，pH 大于3.5 时，柠檬烯产生分子内重排，通过不同碳原子的羟基化反应、异构化反应、氧化反应和断裂循环，促进了柠檬烯含氧化合物的形成[23]。pH 大于7.0 时，α-萜品醇浓度降低，原因可能是碱性条件下的α-萜品醇性质不稳定。Bicas 等[30]报道尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 152b 在pH 5.2～8.2 之间生物转化柠檬烯生成α-萜品醇；Gloria 等[23]报道指状青霉Penicillium digitatum DSM 62840 转化柠檬烯的最适pH 为3.5，此pH 下α-萜品醇产量最大。Tan 等[31]的研究也发现Penicillium digitatum NRRL 1202 在酸性环境下更利于生物转化，在pH 4.0 时产量最高。与这些真菌略有不同，P.oryzihabitans F0-1 在pH 小于5 时无法转化，在6.0～7.0 的微酸性反应体系中转化柠檬烯合成α-萜品醇的产量最高。

图7 体系pH 对α-萜品醇产量影响Fig.7 Effects of system pH values on the α-terpineol production

2.5.3 转速对α-萜品醇产量的影响

萜烯生物转化为含氧衍生物是需氧的[32]，溶氧量对产物转化量影响较大，振荡培养可以提高体系的溶氧量[33]。在假丝酵母Candida maltosa 生物转化过程中，其关键酶NADPH-cytochrome P-450 和cytochrome P-450 单加氧酶在60 r/min 时的转化效率更高[34]。图8 显示在转速为200 r/min 时，α-萜品醇的产量最高，达到97.54 mg/L，当体系静止或处于过高转速时都不利于生成产物，因此选用中等转速200 r/min 作为生物转化培养条件。

图8 转速对α-萜品醇合成的影响Fig.8 Effects of rotational speeds on the α-terpineol production

3 结论

从新鲜酒花中筛选出能转化(R)-(+)-柠檬烯合成α-萜品醇的内生菌F0-1。对该菌株进行生理生化和分子生物学鉴定，为栖稻假单胞菌Pseudomonas oryzihabitans。并对F0-1 菌生物转化的条件进行了优化，F0-1 菌在30 ℃，体系pH 为6.0，转速200 r/min的NA 培养基中预培养38 h，添加20%的柠檬烯/乙醇溶液，柠檬烯浓度为880 mg/L，转化12 h，得到的α-萜品醇浓度为（97.54±3.34）mg/L，是最初转化结果（9.24±1.67）mg/L 的10.6 倍。