AIT 阶段微生物灭菌技术在行星保护任务中的应用与发展

袁俊霞，邹乐洋，孙振业，黄伦伦，赵继丁，张兰涛，徐侃彦

（1. 航天神舟生物科技集团有限公司； 2. 北京市空间生物工程技术研究中心：北京 100190；3. 北京空间飞行器总体设计部，北京 100086； 4. 北京卫星环境工程研究所，北京 100094）

0 引言

对地外生命及其相关物质的探测是深空探测任务的主要目标之一。为了避免探测器对目标星体的生物污染，对地外星体开展飞越、环绕、着陆和巡视等形式的深空探测活动时必须实施行星保护任务，即采用适宜的微生物控制技术进行前向污染防护以保证探测结果的正确性；同时，也应避免将未知的地外物质带回地球，对地球生物圈造成危害[1-2]。根据深空探测任务的目标和类型不同，国际空间研究委员会（COSPAR）采用了以任务等级划分为核心的行星保护指导方法，将行星保护划分为5 级，并制定了具体的微生物控制要求。以火星探测中IVa 类任务为例，要求探测器表面的微生物密度≤300 个/m2芽孢，探测器表面的微生物总量≤3×105个芽孢，而对于从事地外生命探测的探测器则要求更高[1-3]。NASA 的行星保护政策文件NPR 8020.12D 中详细规定了探测器执行地外探测任务的行星保护具体要求，包括以着陆、飞越或以其他方式到达目标星体前的前向污染控制，以及可能来自地外天体的返向污染控制要求[4]。

“海盗号”火星探测计划是人类历史上第一次登陆可能存在生命的地外星球并进行地外生命调查的行为，采取了美国深空探测以来最严苛的微生物控制措施[5]。通过对探测器的元器件、部组件、系统进行清洁、灭菌以及对探测器的二次污染防护等微生物控制手段，确保探测器在探测火星生命时的洁净度符合行星保护要求[5-7]。

在微生物控制环节中，实现探测器硬件的微生物灭菌是保障洁净度的重要一环。近年来，干热灭菌、气相过氧化氢灭菌、辐照灭菌、化学消毒剂灭菌等技术被先后用于探测器组装建造阶段。本文通过调研现阶段国外在探测器研制过程中采用的主要微生物灭菌技术，分析其技术现状与特点，并提出未来我国在深空探测器建造中微生物灭菌技术的发展思路。

1 AIT 阶段的微生物

在“海盗1 号”和“海盗2 号”研制过程中，NASA从探测器表面采集了大约7000 个样品，数据分析显示：产芽孢菌是探测器携带的典型污染物[8]。近年来，对国外多个深空探测器的微生物组成分析也与该结果保持一致[9-11]。基于培养法对我国某AIT（组装、集成与测试）厂房进行环境微生物采样和检测数据表明，AIT 环境微生物中产芽孢菌含量占细菌总量的50%～60%[12]。芽孢是细菌在生长发育后期为了抵御外界不良环境而形成的含水量低、抗逆性强的休眠体，具有极强的环境耐受性。AIT 环境中的高洁净条件对处于其中的产芽孢菌构成了极高的选择压力，一些能在极端严苛环境条件下生存的产芽孢菌具备更强的耐受性，上述因素进一步增大了AIT 环境中微生物灭菌的难度。NASA 从AIT 厂房中分离得到的一株短小芽孢杆菌Bacillus pumilusSAFR-032 对全紫外波谱的抗性与标准菌B. pumilusATCC 7061 相比提升约300 倍，暴露在5%的过氧化氢溶液中存活率提升了12%[13-14]。因此，在行星保护任务实施过程中，针对探测器的微生物灭菌效果也以杀灭芽孢的数量级来表征。

2 干热灭菌技术在行星保护任务中的应用

干热灭菌（dry heat microbial reduction, DHMR）是指通过对流、传导、热辐射、红外等方式加热干燥空气进而实现灭菌的技术，具有操作简单、穿透性好、灭菌条件及效果易测定、无灭菌剂残留等优点，是经NASA 和ESA 批准可以在探测器硬件洁净度控制中使用的微生物灭菌技术[15]。DHMR 的灭菌原理是高温干热过程使微生物的酶受热变性，细胞内的DNA 被破坏，细胞膜受损而导致微生物死亡[16]。

2.1 DHMR 技术规范

20 世纪60 年代， DHMR 技术最先被用于“海盗号”探测器的行星保护任务。在NASA 最初的NPR 8020.12D 文件中，针对微生物所在的不同探测器结构，如表面暴露、耦合结构（微生物位于结合面）及封装结构（微生物包埋于航天器材料中），测定干热条件下将微生物数量降低1 个数量级（1log，即杀灭90%微生物）所需的时间-温度相关性[17]。受技术发展条件限制，DHMR 的灭菌温度控制范围通常为104～125 ℃，在特殊情况下可达146 ℃；湿度控制相当于在0 ℃和1 个大气压下相对湿度的25%；DHMR 灭菌效果也被限定于实现4 个数量级的微生物降低。利用DHMR 技术，NASA 最终实现对“海盗号”整器级灭菌，将芽孢数量从300 000 个（灭菌前）降低至30 个芽孢（灭菌后）[18]。同时，基于NASA 在“海盗号”任务中的成功经验，实施DHMR 所需的操作程序、灭菌设备、灭菌周期、包装、环境条件、验证标准等规范被应用于“火星探路者”（MPF）、“火星极地着陆器”（MPL）、“火星漫游者”（MER）和“火星科学实验室”（MSL）等探测器的硬件灭菌，包括安全气囊、蜂窝型部件、降落伞、推进剂箱等[19-21]。

2011 年起，喷气推进实验室（JPL）在整合最新干热灭菌研究结果的基础上重新修订了NPR 8020.12D中的DHMR 实施规范，见表1。具体修订项包括：1）灭菌实施温度从104～125 ℃修订为最高200 ℃，实现绝对无菌的条件是在500 ℃时灭菌时间≥0.5 s；2）灭菌过程允许使用普通环境烘箱代替真空烘箱，简化试验要求并降低成本；3）DHMR 允许在≥125 ℃条件下实现对微生物数量6 个数量级的降低[17]。然而，为了实现4～6 个数量级的微生物杀灭效率，在相同灭菌温度下，DHMR处理时间将显著延长，或在相同的时间内采用更高的灭菌温度。以“凤凰号”（Phoenix）探测器为例，耦合面的微生物DHMR参数最低为112 ℃、37 h；“洞察号”探测器中的参数最低是112℃、132.2 h[18]。

DHMR 技术在ESA 的探测器研制中也被广泛使用。ESA 利用DHMR 技术实现了对行星保护等级为IVa 类的“猎兔犬2 号”元器件的灭菌。在ESA正在研制的ExoMars2022中，设计了用于生命探测的火星有机分子分析仪-质谱仪（MOMA-MS），其生物负载要求是：取样设备管路内部表面微生物不超过0.03 CFU/m2；外部和非样品管路表面微生物300～1000 CFU/m2。对MOMA-MS 的微生物灭菌主要通过DHMR 实现[22-23]。ESA 在ECSS-Q-ST-70-57C 标准文件规定的DHMR 技术规范参数与NASA 相似，具体是：温度控制110～200 ℃；绝对湿度控制＜1.2 g/m3，相当于在0 ℃和标准大气压下相对湿度的25%，或20 ℃和标准大气压下相对湿度的7%[24]。

2.2 DHMR 生物指示剂

对DHMR 的灭菌效果验证主要通过对经灭菌处理的生物指示剂的菌落计数获得。目前，NASA 和ESA 采用的DHMR 生物指示剂主要是枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus atrophaeusATCC9372与Bacillus sp.ATCC29669。B. atrophaeusATCC9372由于具有优良的抗干热特性，已被作为标准菌株在国际灭菌质量控制领域广泛应用。同时，B.atrophaeus也是NASA 在探测器建造洁净室中分离的常见菌种[25]，因此，B. atrophaeusATCC9372菌株通常被用于降低2～3 个数量级的灭菌效果验证。此外，Bacillus sp.ATCC29669 分离自“海盗号”探测器组装洁净室中，是目前已知的最耐热的产芽孢菌株之一[26-27]。研究结果显示：对Bacillus sp.ATCC29669 进行1 个数量级的杀灭所需时间是B.atrophaeusATCC9372 的20～35 倍[17,28]，因此，NASA 将实施DHMR 的灭菌温度提高至200 ℃，并将Bacillus sp.ATCC29669 用作微生物4～6 个数量级降低试验的生物指示剂。

2.3 DHMR 与材料相容性

空间探测任务的多样化与复杂化发展，对探测器材料也提出了高性能、高稳定、长寿命、高可靠的指标要求[29]。在DHMR 实施过程中，高温、干热环境对航天器材料的影响不容忽视，包括：材料由于加热所导致的降解、破裂、断裂，或由于膨胀导致尺寸变化、废气排放等直接效应；材料结晶度改变、老化加速、排放废气后引起的再次污染等间接效应；产生长期活性中心（如自由基）和后续的降解反应引起的长期效应[30]。因此，在对探测器硬件进行灭菌前，需要基于大量试验验证灭菌技术与材料的相容性。如图1 所示，相容性评价主要对灭菌处理前后材料的性能指标变化进行统计分析。实施DHMR时，对于金属材料，灭菌温度、处理次数主要影响材料的力学性能与耐腐蚀性能；对于高分子材料及其复合材料如垫圈、密封、胶粘材料等，除了关注材料的耐温范围外，耐高低温冲击性能以及逸出和分解产生有害气体的毒性也需要重点关注。同时，由于干热灭菌过程中材料的热膨胀系数会改变，因此，应结合拟用环境对高分子材料的蠕变及应力松弛特性进行验证。ESA 针对部分探测器材料开展的材料相容性评价测试如表2 所示。

图1 微生物灭菌技术与材料相容性评价流程Fig. 1 Microbial sterilization technique and material compatibility evaluation

表2 ESA 开展的DHMR 技术与材料相容性研究示例[30]Table 2 Example of DHMR sterilization compatibility studies conducted by ESA[30]

尽管DHMR 长期以来一直是NASA 和ESA等机构对探测器进行微生物灭菌的主要方法，但它被证明存在一定技术局限性：1）使用DHMR 灭菌时需要考虑材料的相容性，不耐热的材料难以适用[15]；2）多次系统级高温灭菌对部分材料会产生性能影响，最终导致设备损坏[20]；3）高温加热过程会产生高运行成本以及长时间成本等[6]。

3 气相过氧化氢灭菌技术在行星保护任务中的应用

针对一些不耐高温的材料的微生物灭菌，气相过氧化氢（vaporized hydrogen peroxide, VHP）灭菌技术被NASA 和ESA 批准作为DHMR 的补充技术[31-32]，其主要的灭菌机理是：过氧化氢通过形成羟基自由基、活性氧等物质对微生物形成氧化胁迫而杀死微生物[32]。如图2 所示，典型的VHP 灭菌过程分为除湿、气化、灭菌和通风4 个阶段。为了确保过氧化氢蒸气的高浓度、均一性和安全性，所有阶段都在一个密闭腔室内进行。VHP 技术已经在医疗、食品和运输行业中广泛应用，美国曾将该技术用于炭疽粉末污染的灭菌处理[15,33]。

图2 VHP 灭菌阶段[18]Fig. 2 VHP sterilization stage[18]

3.1 VHP 技术规范

近年来，JPL 与STERIS 公司开发出用于行星保护任务的VHP 灭菌设备，并联合ESA 开展了广泛的灭菌验证研究。目前，NASA 已经建立并审查了关于VHP 的技术规范，但尚未正式发布。ESA在标准ECSS-Q-ST-70-56C 中对VHP 灭菌技术进行了详细规定[34]：VHP 可以在“受控环境条件”或“受控真空条件”下进行。受控环境条件一般指：标准大气压，25～45 ℃，相对湿度3%～50%（35 ℃下测定）；受控真空条件一般指：压力范围130～330 Pa，25～45 ℃[12]。在上述受控环境条件下，NASA/ESA对VHP 灭菌技术的灭菌规范定义为：1）VHP 技术适用于对探测器表面2～6 个数量级的微生物灭菌；2）在“受控真空条件”下表面灭菌的过氧化氢蒸气浓度需介于0.5～1.1 mg/L；在“受控环境条件下”表面灭菌的过氧化氢蒸气浓度需≥1.1 mg/L；3）实现探测器表面微生物总量降低1 个数量级的最低控制条件是200 (mg/L)s。VHP 灭菌过程的效应是逐步累积的，如当环境条件累积达到600 (mg/L)s可以降低3 个数量级微生物。在JPL 开展的试验中曾利用1 mg/L、30 min 灭菌，累积过氧化氢蒸气达到1800 mg/L，实现对9 个数量级微生物的降低[18]。对VHP 灭菌效果主要通过对生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilusATCC7953与枯草芽孢杆菌黑色变种B. atrophaeusATCC9372进行验证。

3.2 VHP 与材料相容性

为了保证探测器表面的生物负载能够满足行星保护要求，NASA/ESA 在探测器研制中已经使用VHP 技术对一些部件进行表面灭菌，如Micro-D微型连接器、阳极氧化铝板、环氧树脂等[18,33]。目前，VHP 已被应用于对“猎兔犬2 号”、“ExoMars2022”等探测器元器件的灭菌。

实施VHP 灭菌须重点考虑过氧化氢的腐蚀性与活泼的氧化性引起的材料相容性。Conley 等认为VHP 对多数金属与非金属材料具有良好的相容性，如2024 铝合金、7075 铝合金、304 不锈钢、316不锈钢和ABS 等材料在VHP 处理后都未显示出机械性能的明显变化；但是对一些铜基材料进行灭菌时，过氧化氢可以与其发生氧化还原反应，材料相容性较差[35-36]。

与DHMR 相比，VHP 技术具有快速、高效的特点，可以在常温或低温下有效杀灭微生物，是热敏零件灭菌的理想选择。然而，VHP 是一种非渗透性杀菌技术，只能减少结构表面的微生物，对于复杂器件结构则难以达到深层灭菌的目的[20,35]。

4 其他灭菌技术在行星保护任务中的应用

γ 辐射是一种高能形式的电离辐射，通过使介质中的某些物质氧化或产生自由基作用于生物分子而使微生物失活；最常见的辐射源是钴60。根据现有研究数据，杀灭大多数芽孢的辐射剂量大约为25 kGy，采用的辐射剂量主要取决于待灭菌的材料和生物总量[37]。研究显示，γ 辐射与DHMR 技术联用时，具有协同效应。与DHMR 或单独的γ 辐射相比，两者联用可以在较低温度（95～110 ℃）、较低辐射剂量（＜1.5 kGy）和较短的处理时间（≯15 h）下实现枯草芽孢杆菌黑色变种B. atrophaeus和其他常见芽孢的4～7 个数量级降低[33,38]。该方法适用于能够同时承受高温和辐射环境的元器件、部组件及系统灭菌。

低温等离子体灭菌技术是一种新型的灭菌技术，主要作用机理是如空气、氩气、氮气等反应气体在电场作用下，被解离为带电粒子形成等离子体、羟基自由基以及辐射出紫外线，对微生物形成全方位的杀灭环境[39]。低温等离子体灭菌技术具有灭菌温度低、时间短和无毒性等诸多优点，对温度热敏感材料灭菌显示出了独特的技术优势。近年来，NASA、ESA 等机构都在致力于低温等离子体灭菌技术的开发，并开展了大量验证试验。研究显示：低温等离子体技术可以在短时间内将耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans、嗜热脂肪芽孢杆菌G.stearothermophilus、枯草芽孢杆菌黑色变种B.atrophaeus等微生物的总量降低3～6 个数量级[40-42]。

5 微生物灭菌技术发展分析

分析NASA、ESA 在微生物灭菌技术领域的发展特点，可以发现：对探测器硬件实施微生物灭菌是把双刃剑：一方面，它能够满足行星保护任务要求，从而保障探测任务的可靠性与有效性；另一方面，微生物灭菌过程在一定程度上也会导致探测器硬件的功能受损。因此，如何选择对探测器硬件安全、可靠的微生物灭菌技术成为深空探测任务实施和管理新的挑战。如表3 所示，在现行的微生物灭菌技术体系中，DHMR 是唯一经NASA 大规模测试的灭菌技术，在材料和元器件水平已经积累了大量的研究基础，目前NASA 正重点开发适用于大型探测器部组件的灭菌设施；VHP 技术、γ 辐射等技术已经广泛应用于医疗、食品、航空及航天等领域，但多以简单的材料灭菌为主，未来需要进一步对探测器等具有复杂几何形状的结构进行灭菌效率验证；低温等离子灭菌等技术仍处于起步阶段，未来需要充分探索该技术在行星保护任务中的适用性。

表3 常见微生物灭菌技术在航天器工程的应用Table 3 Application of microbial reduction techniques in spacecraft engineering

同时，航天新技术、新材料的发展也将进一步催生新的微生物灭菌技术、规范和标准的形成。以DHMR 技术为例，随着NASA 科学家对探测器建造环境中耐热微生物的认知逐步加深，特别是以Bacillus sp.ATCC29669 为代表的极端耐热菌株的分离与发现，以及对耐热芽孢灭活动力学和热致死效应研究的深入，NASA 将DHMR 灭菌的最大允许温度从125 ℃提高至200 ℃[25]，以满足行星保护任务要求。

目前，我国部分研制单位已经搭建了DHMR、辐照灭菌、低温等离子体灭菌系统，并对我国探测器材料开展了初步的灭菌效果评价与材料相容性研究[43-45]，但现有基础远不能满足我国未来行星保护任务的需要，国外行星保护任务的既有技术体系与标准也不完全适用于我国。为了全面提升我国在深空探测行星保护任务领域的技术实力与影响力，未来应着力从以下3 方面进行布局：

1）结合我国现有探测器的研制现状，梳理我国探测器建造过程中环境微生物组成、丰度和遗传特征，评估我国探测器负载的微生物总量与分布特征，从而有针对性地制定适用于我国AIT 环境的微生物灭菌技术；

2）以我国现有探测器研制任务为基础，分析探测器的材料选型、结构设计、研制流程等特征，对探测器常用材料与结构建立相应的微生物灭菌技术体系，开展微生物灭菌技术与材料相容性分析验证，为后续开展探测器硬件的微生物灭菌奠定技术基础；

3）我国应紧随前沿科学技术发展，不断开展新技术验证，逐步建立适用于我国探测任务的行星保护全流程技术体系、规范与标准。

6 结束语

随着我国深空探测活动的不断深入，行星保护任务中微生物控制的重要性突显，其中包括深空探测器在AIT 阶段的微生物洁净度控制。本文总结了用于探测器硬件的几种主要的微生物灭菌技术，对其技术规范和与材料的相容性等进行了综述。与美国和ESA 等国家和机构相比，我国针对深空探测器硬件的微生物灭菌技术积累相对有限。开发灭菌效率更高、对深空探测器材料影响更小的新型技术是我国微生物灭菌技术研究的方向。