手撕兔肉抑菌剂的筛选与复配

袁 洋

(厦门工商旅游学校，福建 厦门 360001)

1 材料与仪器设备

1.1 抑菌剂

茶多酚：食用级，郑州皇朝化工产品有限公司；壳聚糖：食用级，郑州皇朝化工产品有限公司；nisin：食用级，连云港友进食品添加剂技术开发有限公司。

1.2 受试菌种

以四种即食包装制品中分离和鉴定出的各类腐败菌各一株为受试菌种。

手撕兔肉抑菌试验用受试菌种为产气肠杆菌(E.aerogenes)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、植物乳杆菌(L.xylosus)、热杀索丝菌(B.thermosphacta)。

1.3 培养基

Pseudomonades培养基、VRBGA培养基、MSA培养基、STAA琼脂培养基、MRS琼脂培养基。

1.4 仪器设备

Allegra X22型台式高速离心机：北京泰亚赛福科技发展有限责任公司；BS224S型电子精密天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；DHG-9148A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HSX-250型恒温恒湿培养箱：上海福玛实验设备有限公司；HVE50型高压灭菌器：北京泰亚赛福科技发展有限责任公司；HH8型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；SW CJ1F型单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；BCD-203型电冰箱：海信(北京)电器有限公司；KDN-08A型半微量定氮仪：山东鄄城华鲁仪器公司；打孔器(7 mm直径)：上海禾汽玻璃仪器有限公司。

2 方法

2.1 抑菌剂浓度的设定

按三种抑菌剂允许的最大使用浓度(茶多酚0.03 g/100 mL、壳聚糖0.6 g/100 mL、nisin 0.05 g/100 mL)配制溶液设为实验组，并以不加抑菌剂作为空白对照。

2.2 抑菌试验

(1)菌悬液的预制备。取受试菌种接种于相应斜面上，在37 ℃条件下活化培养24 h，用5 mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液，细菌浓度约为109CFU/mL。

(2)培养基打孔、菌悬液抑菌剂的加入。在无菌平板内倒入冷却至50 ℃的各类培养基约20 mL，待其凝固。用1 mL无菌吸管取200 μL的菌悬液于相应的灭菌平皿中，在培养基平板上将菌悬液涂均匀，放置1 h。用外径6 mm的无菌金属打孔器在培养基上等距离打孔3～4个，并挖出孔内培养基，然后于每孔内滴加少量0.5%琼脂封底，再分别加入各类抑菌剂100 μL。

3.贫困人口获得健康能力低下，直接降低了健康扶贫政策的实际绩效。单纯疾病治疗缺乏可持续效果，贫困者自身不能在扶贫中发挥有效作用，这也是目前健康扶贫的突出问题。阿玛蒂亚·森充分强调了个人可行能力的重要性，“仅仅关注人们如何实现功能性活动是不够的，关注一个人是否有能力去实现功能性活动也是同等重要的”。［12］世界卫生组织《阿拉木图宣言》也提出了初级卫生保健九个部分内容，健康教育，食品供给及适当的营养，安全饮用水，基本卫生设施，妇幼保健，免疫接种、地方性疾病预防，普通疾病和受伤的治疗，基本药物供给等，这些政策体现了以提升贫困者健康可行能力为基础的整体性政策建构。

(3)最小抑菌浓度的确定。将上述培养基平板置于37 ℃温箱中，培养24 h，测定抑菌圈直径大小，直径大于7 mm可判为抑菌有效。将有效抑菌剂之最低浓度确定为最小抑菌浓度。

2.3 抑菌剂的复配优化

2.3.1 手撕兔肉复合抑菌剂的添加

复合抑菌剂均在食品熟制并冷却后加入，真空包装，备检。每袋手撕兔肉样品的重量约35 g，置于35 ℃温箱中保藏，21 d后测定样品的挥发性盐基氮(TVB-N)含量。

2.3.2 挥发性盐基氮的测定

参照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》，采用半微量凯氏定氮法对TVB-N值进行测定。

2.3.3 响应面试验设计

根据单因素实验结果，进行响应面试验设计。通过回归方程的构建，拟合因素与响应值之间的函数关系，寻求最优的变量组合。

3 结果与分析

3.1 抑菌剂对手撕兔肉抑菌效果的单因素实验

对三种天然抑菌剂的抑菌效果进行单因素实验，结果见表1。

表1 三种天然抑菌剂对手撕兔肉菌株的抑菌效果

当茶多酚浓度为0.006%时，对各菌株无抑菌效果；浓度为0.012%时，抑菌效果不明显；浓度为0.018%时，荧光假单胞菌抑菌圈直径为7.1 mm，即茶多酚对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度为0.018%；浓度为0.024%时，对产气肠杆菌有抑菌效果，抑菌圈直径为7.2 mm；茶多酚对植物乳杆菌、热杀索丝菌、木糖葡萄球菌无抑菌作用。

当壳聚糖浓度为0.12%时，抑菌效果不明显；浓度为0.24%时，抑菌效果明显，荧光假单胞菌抑菌圈直径为7 mm，植物乳杆菌抑菌圈直径为7.1 mm；浓度为0.36%时，对木糖葡萄球菌抑菌效果明显，抑菌圈直径为7.3 mm；壳聚糖对热杀索丝菌和产气肠杆菌无抑菌作用。

当nisin浓度为0.01%～0.02%时，对各种腐败菌均无明显抑制效果；浓度为0.03%时，抑菌效果明显，木糖葡萄球菌抑菌圈直径为7.2 mm，热杀索丝菌抑菌圈直径为7.4 mm；浓度为0.04%时，植物乳杆菌抑菌圈直径为7.2 mm；nisin对荧光假单胞菌、产气肠杆菌无抑菌作用。

3.2 手撕兔肉抑菌剂的复配优化

采用Box-Behnken试验设计，对茶多酚、壳聚糖和nisin三个因素进行优化组合，响应值为TVB-N值，各因素及水平见表2，试验结果见表3。

表2 响应面因素水平

表3 Box-Behnken设计方案及试验结果

使用软件对试验数据进行二次回归拟合，TVB-N实测值=9.57-1.20*A-0.31*B-1.40*C-1.85*A*B+0.000*A*C-0.14*B*C+1.38*A2+0.51*B2+0.70*C2。

通过方差分析进一步验证回归模型及各参数的显著性，结果见表4。

由表4可知，该响应模型的P=0.0008，说明模型的拟合度较好；失拟项P=0.1473，差异不显著，说明该回归模型不失拟。经软件分析，该模型的决定系数R2为0.9527，表明模型的拟合度很好；校正决定系数为0.8920，表明有10.8%的变异不能用该模型解释；变异系数C.V.%=5.73%，信噪比(Adeq Precision)=12.977，表明该试验误差小。

表4 TVB-N方差分析的二次响应模型

利用软件绘制三种复合天然抑菌剂对手撕兔肉TVB-N值影响的响应面图和等高线图(见图1、图2、图3)，对因素之间的交互作用进行分析。

图1 茶多酚和壳聚糖对手撕兔肉TVB-N值影响的响应面和等高线

图2 茶多酚和nisin对手撕兔肉TVB-N值影响的响应面和等高线

图3 壳聚糖和nisin对手撕兔肉TVB-N值影响的响应面和等高线

使用响应面软件对模型方程求导，得出曲面极值点(TVB-N最小值)为7.2488 mg/100 g，对应的茶多酚浓度为0.03%、壳聚糖浓度为0.48%、nisin浓度为0.05%。