重庆綦江赶水地区库蠓及其胃血血源分子鉴定

卢 雪,汪 琳,徐媛媛,刘江欣,代青浪,侯晓晖

库蠓(CulicoidesLatreille,1809)隶属于双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)库蠓属(Culicoides),是已知吸血蠓类中,数量最庞大的一个属,广泛分布于世界各地。截至2020年,全球已发现1 347种,我国已知480种[1-2]。库蠓体型微小,具有吸血特性,可直接侵袭人和动物,并在吸血过程中造成人或动物真皮层机械损伤,类似于马蝇(虻科Tabanidae)、黑蝇(蚋科Simuliidae)和蜱虫(蜱总科Ixodoidea)等吸血昆虫[3]。为了便于嗜血,库蠓唾液中含有抗凝血因子、蛋白酶抑制剂和免疫调节蛋白[4-5],当其吸食受到病毒感染的宿主后,其唾液便可携带有病毒性或非病毒性病原体,如乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)、Schmallenberg病 毒(Schmallenberg virus,SBV)、卡氏住白虫(Leucocytozooncaulleryi)等[6-7]。因此,作为虫媒病毒的重要载体,库蠓可对人和动物造成一定的危害,在疾病传播研究领域中具有不可忽视的地位。

昆虫媒介载体与其取食动物之间的接触频率同病原体扩散及传播的风险密切相关,故吸血蠓种类鉴定、吸血习性及其胃血来源鉴定是蠓媒传染病流行病学调查的重要内容及防治的基础。吸血蠓的吸血习性及取食偏好研究主要是通过其在不同生境中吸血率的生态学调查来反映[8-9]。随着分子生物学技术的发展,基于分子标志的检测技术也被应用于吸血蠓胃血来源的鉴定[10],国内仅见刘仰青等人利用PCR技术对库蠓的取食偏好进行研究[11]。COⅠ基因存在于线粒体基因组中,相比线粒体其他基因,其具有较为保守的结构及大小,同时包含大量遗传信息,且在同一物种不同个体之间仅有1%～2%的差异,而不同物种之间差异则较大[12-13],是目前应用较多的分子标记。重庆地处我国西南地区,由于其地理条件复杂,动植物多样,植被繁茂且农村覆盖面积相对较广,有利于吸血库蠓的繁殖和生存。因此,本研究基于不同物种COⅠ基因,对重庆綦江赶水地区库蠓的胃血来源进行种属鉴定,此项工作有助于了解库蠓可能的取食偏好及病原体传播的类群,为该地区疾病防治工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 生活环境调查 调查现场选择在重庆市綦江区赶水镇周边村落(28°75′40″N,106°72′75″E),该地区为典型的人、畜混住类型,水稻和蔬菜为当地农民主要的农作物。村落内住房主要由钢筋水泥混凝土结构和旧式瓦房组成,各村落内有鸡、鸭、猪、牛和羊等家畜家禽,且禽畜厩舍多紧邻人居住房。

1.2 库蠓的采集 2019年7月16日至7月28日,研究人员先后在4种不同圈舍(猪舍、羊舍、鸡舍及鸡鸭混合舍)灯诱蠓虫,每个采集点分别设置1～2盏光触媒诱虫灯(购自武汉恒冠生物科技有限公司),该灯挂于距地面约1.5 m处,于当日日落后傍晚时分挂灯(18:00－19:00)至次日清晨收灯(6:00－7:00),持续灯诱12 h,每种生境采集两晚。将采集到的库蠓用乙酸乙酯(购自天津市富宇精细化工有限公司)麻醉后保存于75%乙醇中,后续进行分类和鉴定。

1.3 库蠓标本制作及鉴定 将采集的库蠓初步分类并计数,挑出饱血库蠓,在体视镜下利用解剖针将饱血腹部分离,再将其余部分制成永久玻片,根据虞以新等[14]的方法进行形态分类鉴定。

1.4 库蠓腹部血粉及寄主DNA提取 将分离出来的饱血腹部血粉单独装入EP管中,先与其胸部和头部标本匹配标记,再用蒸馏水漂洗2次,最后利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取其DNA,置于－20℃保存备用。此外,寄主动物的血液或组织DNA也利用上述试剂盒进行提取及保存。

1.5 寄主来源PCR鉴定 根据不同物种(猪、人、羊、鼠、鸭、鸡、牛和犬)的COⅠ基因序列差异,设计其特异性引物(表1),由上海生工生物工程有限公司合成。以腹部血粉DNA为模板,分别加入8种常见寄主动物COⅠ基因的特异性引物进行PCR扩增,其反应体系为:2×Taq PCR Master Mix 4.5μL;引 物p1(100 pmol/L)0.2 μL;引 物p2(100 pmol/L)0.2 μL;模 板DNA 1 μL;dd H2O 6.6μL,总体积12.5μL;反应条件为:95℃预变性5 min,1个循环;94℃变性30 s,不同引物的退火温度不同,即猪为53℃、人为54.9℃、羊为55.6℃、鼠为56.5℃、鸭为57.4℃、鸡为58.5℃、牛为59.4℃、犬为61℃,退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃延伸10 min,1个循环;最后,4℃保存。PCR扩增设置阴性对照和阳性对照,阴性对照以dd H2O来代替DNA模板,阳性对照以不同动物的DNA为模板,以避免出现假阳性或假阴性结果。阳性对照中人血样本来自志愿者静脉采集,鼠血样本来自实验小鼠,猪、羊、鸡、鸭、牛和犬的样本购自超市或农贸市场。

表1 8种用于血源鉴定的特异性引物Tab.1 Eight specific primers for blood source identification

1.6 PCR产物检测 取5μL PCR扩增产物,用1%琼脂糖凝胶电泳分离,与DNA Marker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小,根据表1确定模板结果,即同一库蠓腹部血粉DNA扩增出1种、2种或多种条带,提示该库蠓可吸食1种、2种或多种寄主动物血液。

2 结 果

2.1 种类组成 本次调查共采集吸血库蠓1 796头,经形态学鉴定有4亚属9种:各蠓种名录如下:

(1)带纹亚属(SubgenusBeltranmyiaVargas,1953)

①荒川库蠓(C.arakawaiArakawa,1910)(2)二囊亚属(SubgenusAvaritiaFox)

②洋岛库蠓(C.kinabaluensisWirth et Hubert,1989)

③连斑库蠓(C.jacobsoniMacfie,1934)

④琉球库蠓(C.actoniSmith,1929)

⑤条带库蠓(C.tainanusKieffer,1916)

(3)库蠓亚属(SubgenusCulicoidesLatreille,1809)

⑥新替库蠓(C.newsteadiAusten,1921)

⑦刺螫库蠓(C.punctatusMeigen,1804)

(4)屋室亚属(SubgenusOecactaPoey,1853)

⑧尖喙库蠓(C.oxystomaKieffer,1910)

⑨陵水库蠓(C.lingshuiensisLee,1975)

2.2 种群组成 重庆綦江赶水地区的优势蠓种为荒川库蠓(C.arakawai,72.44%),其次是洋岛库蠓(C.kinabaluensis,18.10%),而其他7种库蠓的数量较少,共占9.47%(表2)。

表2 重庆綦江赶水地区主要库蠓种群组成Tab.2 Community composition of the main hematophagous midges in the Ganshui Town,Qijiang,Chongqing

2.3 不同畜舍主要蠓种的诱捕率 不同畜舍主要库蠓种群组成有所不同,羊舍、鸡舍和鸡鸭混合舍的优势种均为荒川库蠓,分别占捕获总数的75.26%、93.36%和94.29%;而猪舍的优势种则为洋岛库蠓,占捕获总数69.44%(表3)。

表3 重庆綦江赶水地区不同生境库蠓组成Tab.3 Composition of blood-sucking Culicoides in different habitats in the Ganshui Town,Qijiang,Chongqing

2.4 不同畜舍主要蠓种的吸血率 本次调查重庆綦江赶水地区9种吸血库蠓总吸血率为72.10%,除去陵水库蠓(C.lingshuiensis)等其他库蠓因总捕获数过少而不具代表性(仅为25只)外,其中荒川库蠓(C.arakawai)的吸血率最高(79.55%),刺螫库蠓(C.punctatus)的吸血率最低(51.85%);此外,鸡鸭混合舍中总吸血率为81.18%远高于其他圈舍,其他圈舍中羊舍最低仅为65.83%(表4)。

表4 重庆綦江赶水地区不同畜舍主要蠓种的吸血率Tab.4 Blood-sucking rate of predominant midge species in different barns in the Ganshui Town,Qijiang,Chongqing

2.5 不同库蠓血源鉴定结果 将所有样本按照种属、生境进行分类,从中随机抽检190份饱血库蠓胃血样本进行PCR扩增,检测其所对应的寄主动物。抽样率分别为:荒川库蠓(C.arakawai)12.68%:鸡舍16.53%,猪舍0%,羊舍7.14%,鸡鸭舍10.37%;洋岛库蠓(C.kinabaluensis)19.42%:鸡舍100%,猪舍13.89%,羊舍31.25%,鸡鸭舍100%;刺螫库蠓(C.punctatus)60.71%:鸡舍0%,猪舍59.26%,羊舍0%,鸡鸭舍100%;琉球库蠓(C.actoni)100%:鸡舍0%,猪舍100%,羊舍100%,鸡鸭舍0%;尖喙库蠓(C.oxystoma)78.79%:鸡舍0%,猪舍78.13%,羊舍100%,鸡鸭舍0%;陵水库蠓(C.lingshuiensis)92.31%:鸡舍92.31%,猪舍0%,羊舍0%,鸡鸭舍0%。由图1可知,6头荒川库蠓饱血腹部血粉的PCR鉴定结果,其中1号泳道为阴性对照,2号泳道为鸡源阳性对照,3～8号泳道为不同编号的荒川库蠓胃血PCR扩增条带,片段大小为240 bp。由图2可知,1头琉球库蠓饱血腹部血粉的各血源PCR鉴定结果,其中猪泳道为阳性,条带大小为506 bp、羊泳道为阳性,条带大小为338 bp、鸡和牛泳道也为阳性,条带大小分别为240 bp和784 bp。

图1 PCR扩增荒川库蠓C.arakawai胃血(鸡血源)结果Fig.1 Results of PCR amplification of C.arakawae blood meal(containing DNA of chickens)

图2 PCR扩增琉球库蠓C.actoni胃血(各血源)结果Fig.2 Results of PCR amplification of C.actoni blood meal(all blood sources)

检测荒川库蠓(C.arakawai)的胃血72份,鸡源血72份,占100.00%;鸭源血14份,占19.44%;牛源血6份,占8.33%;鼠源血3份,占4.17%;只检出人源血1份,占1.39%;未检出猪、犬和羊血源。因此,荒川库蠓的吸血对象为鸡、鸭、牛、鼠和人5种。

检测洋岛库蠓(C.kinabaluensis)的胃血40份,鸡 源 血38份,占95.00%;羊 源 血31份,占77.50%;猪源血28份,占70.00%;牛源血6份,占15.00%;鸭 源 血2份,占5.00%;鼠 源 血1份,占2.50%;未检出人和犬血源。因此,洋岛库蠓的吸血对象为鸡、羊、猪、牛、鸭和鼠6种。

检测刺螫库蠓(C.punctatus)的胃血17份,羊源血11份,占64.71%;猪源血10份,占58.82%;牛源血6份,占35.29%;鸡源血4份,占23.53%;未检测出鼠、人、鸭和犬源血。因此,刺螫库蠓的吸血对象为羊、猪、牛和鸡4种。

检测琉球库蠓(C.actoni)的胃血23份,鸡源血23份,占100.00%;牛源血16份,占69.57%;猪源血15份,占65.22%;人源血13份,占56.52%;羊源血10份,占43.48%;未检测出鼠,鸭和犬源血。因此,琉球库蠓的吸血对象为鸡、牛、猪、人和羊5种。

检测尖喙库蠓(C.oxystoma)的胃血26份,猪源血23份,占88.46%;羊源血16份,占61.54%;鸡源血15份,占57.69%;牛源血10份,占38.46%;未检测出鼠、人、鸭和犬源血。因此,尖喙库蠓的吸血对象为猪、羊、鸡和牛4种。

检测陵水库蠓(C.lingshuiensis)的胃血12份,鸡源血12份,占100%;鸭源血4份,33.33%;鼠源血1份,占8.33%;牛源血1份,占8.33%;未检测出猪、人、羊和犬源血。因此,陵水库蠓的吸血对象为鸡、鸭、牛和鼠4种。不同生境采集的同种库蠓寄主有所不同(表5)。

表5 (续)

表5 重庆綦江赶水地区6种不同吸血库蠓血源鉴定结果Tab.5 Blood source identification for six different species of Culicoides in the Ganshui Town,Qijiang,Chongqing,China

3 讨 论

本研究在重庆綦江赶水地区的不同圈舍中共捕获9种库蠓,其中荒川库蠓(C.arakawai)所占比例最高,其次是洋岛库蠓(C.kinabaluensis)。此外,本研究中禽类圈舍和羊舍均以荒川库蠓为优势种,这与海南省禽类圈舍吸血蠓调查结果相一致[15],但猪舍的优势种有所不同,后者猪舍和羊舍中尖喙库蠓(C.oxystoma)为主要蠓种;云南地区猪舍和鸡舍吸血蠓调查与本研究结果也不同,其猪舍和鸡舍优势种群为卢特库蠓(C.luteolus)[16]。近年来国内不同地区、不同畜舍生境吸血蠓的调查均发现,同种畜舍、不同地理区域的吸血库蠓优势种类组成不同。

重庆綦江赶水地区是典型的人畜混住生境,这为库蠓提供了多样的血餐来源,故一种吸血库蠓能以1种及以上的动物为吸血对象,如生态学调查发现荒川库蠓(C.arakawai)喜吸食鸡血、兴安库蠓(C.sinanoensis)和刺螫库蠓(C.punctatus)嗜吸牛血、东方库蠓(C.orientalis)偏好吸食猪血[17-18]。近年来,随着分子技术的发展,DNA检测技术也应用于库蠓胃血血源的鉴定,与生态学调查方法相比,用分子鉴定技术研究昆虫血粉的来源,大大提高了在物种水平上鉴定宿主的准确性。自2003年Hebert等提出线粒体COⅠ基因是DNA条形码标准基因后[19],已有越来越多地学者利用COⅠ基因进行昆虫分子分类和系统发育研究,但我国尚未见基于该分子标记进行吸血蠓的胃血来源研究。本研究则是基于COⅠ基因条形码,利用不同物种COⅠ基因序列差异,设计物种特异性引物,采用PCR对库蠓胃部血粉进行扩增,扩增产物条带大小与理论预测值一致。同时,本研究为了避免PCR检测失误对结果造成误判,每次PCR扩增均设置了阳性对照和阴性对照,该方法可以避免出现假阳性和假阴性结果,进而特异性检测出库蠓胃内不同来源的血粉。另外,针对本研究中饱血库蠓的样本量较大,我们分别对不同地点、不同畜舍和不同种类的饱血库蠓进行了抽样,共检测库蠓腹部血粉190份,研究发现,荒川库蠓、洋岛库蠓、琉球库蠓和陵水库蠓均吸食鸡血,其中荒川库蠓除吸食鸡血外,还吸食鸭、牛、鼠和人,与刘仰青等[11]研究结果一致;洋岛库蠓(C.kinabaluensis)还喜食羊血和猪血,分别占77.50%和70.00%,其吸血对象种类多达6种;而尖喙库蠓和刺螫库蠓则偏好吸食猪血和羊血,分别占88.46%、61.54%和58.82%、64.71%,两者的吸血对象还包括鸡和牛,其中刺螫库蠓吸食牛血与Tomazatos等报道相一致[20];此外,本研究还发现琉球库蠓和荒川库蠓除喜食鸡血外,还存在吸食人血的现象,其比例分别为56.52%和1.39%,虽然其他库蠓腹部血粉尚未检测出人血成份,但由于抽检的样本量有限,暂不能判断其他库蠓是否吸食人血。本研究中鸡是6种库蠓的取食对象,与此次调查地区中鸡的分布广、数量多有关;除鸡以外,猪、牛、羊也是洋岛库蠓、尖喙库蠓、琉球库蠓和刺螫库蠓的主要取食对象,这可能与上述4种库蠓具有相似的吸血习性有关。最后,本研究中未检测到犬的血源,这可能与此次采集地区村落中犬的数量较少有关,亦或未抽取到吸食犬血的库蠓样本,具体原因尚需进一步研究。由于本研究样本量相对较大,抽样检测导致检测结果具有一定的局限性,希望在后期的工作中可进一步研究建立多重、快速且更为灵敏的检测方法,批量开展吸血库蠓胃血血源鉴定。

本研究通过对库蠓胃血来源的鉴定,初步明确6种库蠓的吸血习性,主要以4～6种动物为寄主,揭示了不同种类吸血库蠓具有不同的吸血偏好以及存在吸血多样性的特点。此外,当多种动物同时存在时,库蠓选择寄主具有一定的随机性和机会性,其吸血行为被干扰后,可以另一种动物为食。本研究为重庆地区常见库蠓的取食偏好提供了重要的信息,为该地区蠓传疾病的防控提供参考,具有重要的公共卫生意义。

利益冲突:无

引用本文格式:卢雪,汪琳,徐媛媛,等.重庆綦江赶水地区库蠓及胃血血源分子鉴定[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1064-1070.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.155