白黎芦醇体外对多房棘球蚴原头节和微囊的作用研究

高海军,庞华胜,张 妍,霍乐乐,姜 斌,莫筱瑾,雒艳萍,张 颋,,景 涛,徐 斌,马兴铭,胡 薇

多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球绦虫幼虫(多房棘球蚴)寄居于人或哺乳动物引起的一种人兽共患寄生虫病[1]。AE主要分布于北半球,高流行区集聚于中亚及我国西北部,严重威胁着人体健康及畜牧业发展,被视为“虫癌”[2]。多房棘球蚴具有独特的组织器官趋向性,肝脏寄生占97%以上,呈类癌样侵袭生长,可通过血液或淋巴液向肺脑等器官播散[3]。若未得到合理治疗,AE患者10～15年生存率仅为10%左右[4-5]。目前,AE的临床治疗策略主要包括病灶切除、肝脏移植和药物化疗。目前,阿苯达唑(Albendazole,ABZ)作为临床上最主要的棘球蚴病治疗药物,是通过抑制微管聚合和能量代谢进而发挥其抑虫作用[6]。由于AE患者术后易出现复发,ABZ口服吸收效果不佳及长期服用产生的毒副作用明显等[7],因此,寻找新型AE治疗药物成为当前的研究热点。

白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种含芪类结构的非黄酮多酚化合物,广泛存在于葡萄科、百合科、豆科等植物中[8]。已有研究证实,RES具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化和抗血管生成等多种生物功能[9],还具有杀虫(如血吸虫[10]、利什曼原虫[11]和锥虫[12])作用。因此,本研究将探讨RES体外对多房棘球蚴原头节和微囊生长的作用,旨在为AE的临床用药提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及伦理 清洁级雄性长爪沙鼠(Merionesunguiculatus)(体重约75 g)由首都医科大学友情赠送。本实验研究经兰州大学基础医学院动物伦理委员会和中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所伦理委员会同意(授权号:SCX-gan-2009-0004和IPD-2021-27)。

1.2 实验材料

1.2.1 细胞及寄生虫来源 永生化肝癌细胞(Hep G2细胞系)由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所保存;多房棘球蚴原头节来自兰州大学基础医学院的泡球蚴感染的长爪沙鼠。

1.2.2 试剂与仪器 二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),阿苯达唑亚砜(Albendazole sulfoxide,ABZ-SO),白藜芦醇(Resveratrol,RES)购自阿拉丁化学试剂公司;基础培养液(Dulbecco’s modified eagle’s medium,DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)和青霉素-链霉素(Penicillin-streptomycin,P-S)等购自南京维森特生物技术有限公司和台盼蓝染液购买自北京索莱宝科技有限公司,碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase activity,ALP)活性检测试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司;多功能酶标检测仪由美国Bio Tek公司生产,倒置光学显微镜由日本Olympus公司生产,扫描电子显微镜和透射电子显微镜由日本电子株式会社生产。

1.3 实验方法

1.3.1 多房棘球蚴原头节和微囊的分离培养 原头节分离培养步骤参照文献[7],即感染泡球蚴14个月的长爪沙鼠经乙醚麻醉后脱颈处死,置入75%乙醇浸泡10 min,无菌分离泡球蚴组织并将其转移至含20%P-S的无菌磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS),用组织剪去除泡球蚴表面残留的宿主血管与结缔组织,用含1%P-S的PBS漂洗3～4遍,将其剪碎充分释放原头节,经200μm和40μm无菌过滤后收集原头节,再用新鲜DMEM(含1%P-S)漂洗直至其存活率＞98%,最后用含1%P-S的DMEM将其充分重悬,置于37℃、5%CO2条件下培养备用。

在完全培养体系(89% DMEM＋10% FBS＋1%P-S)中,待饲养细胞Hep G2长满至平皿的85%左右,将原头节缓缓加入(1 000 PSCs/皿)平皿继续培养,每隔3～4 d用PBS漂洗并置入新鲜培养体系中继续培养,约4周原头节将发育成微囊,收集微囊备用。

1.3.2 原头节和微囊的体外作用 将原头节种入24孔 板(100 PSCs/孔),设 置PBS组、DMSO组(DMSO终浓度为0.1%)即溶媒对照组、ABZ-SO作用组(ABZ-SO终浓度为40μmol/L)即阳性对照组,RES作用组(RES终浓度分别为5、10、20、40、80、100、200和400μmol/L),每组设置4个复孔,每24 h观察其形态变化并记录存活率,持续观察1周。培养至第6 d,吸取各孔培养上清液100μL进行ALP活性检测。另外,收取PBS、DMSO、ABZSO和RES组原头节,采用0.4%台盼蓝染色观察其形态变化;部分原头节经PBS漂洗3～4遍后,固定于4%戊二醛中,采用扫描和透射电子显微镜观察其超微结构变化。

将收集的微囊种入24孔板(4个/孔),设置PBS组、DMSO组(DMSO终浓度为0.1%)即溶媒对照组、ABZ-SO作用组(ABZ-SO终浓度为40 μmol/L)即阳性对照组,RES作用组(RES终浓度为40μmol/L),每组设置3个复孔,每24 h观察其活力和形态变化,持续观察2周。2周后,收集培养上清并检测其ALP活性。

1.3.3 碱性磷酸酶活性检测 取原头节或微囊培养上清(30μL)、检测缓冲液(20μL)和显色底物(50 μL)进行混匀,后置于37℃孵育15 min后,加入终止液(100μL)终止反应,测定A405nm值,参照试剂盒说明书建立标准曲线并计算ALP活性。

1.3.4 扫描和透射电镜观察 扫描电镜制样操作步骤参照文献[2],即收集的原头节用PBS漂洗3～4遍,置于4%戊二醛固定4 h,用1%锇酸室温避光进行后固定,经梯度乙醇和乙酸异戊酯脱水,真空干燥及喷金后置于扫描电子显微镜下观察。透射电镜制样操作步骤参照文献[13],即原头节经4%戊二醛固定后用无菌PBS洗涤3～4遍,再经1%锇酸进行后固定、梯度浓度丙酮脱水,再经Epon812环氧树脂包埋后切片,铅铀电子染色,在透射电镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 白藜芦醇体外对多房棘球蚴原头节的作用效果 光学显微镜观察显示,5～400μmol/L RES体外持续作用7 d,原头节死亡率呈剂量、时间依赖性升高,其中,400和200μmol/L RES体外分别作用至第1和3 d,原头节死亡率均达100%。当RES浓度降至100、80和40μmol/L时,原头节死亡率分别在第4、5和6 d达到100%,20μmol/L RES作用至第7 d原头节全部死亡。而10和5μmol/L RES作用至第7 d,原头节死亡率仅为(23.75±4.24)%和(20.75±2.83)%。截至第7 d,40μmol/L ABZSO作用组原头节死亡率为(13.25±1.41)%,DMSO组为(6±0.71)%(图1)。

图1 白藜芦醇体外对多房棘球绦虫原头节的作用效果Fig.1 Effect of RES on E.multilocularis PSCs in vitro

化学发光法显示,不同浓度的RES作用至第6 d,PSCs培养上清中ALP活性呈剂量依赖性增高(F＝36.94,P＜0.001)。在PBS组中,ALP活性为(1.86±0.11)U/L,与DMSO组(1.97±0.18)间 差异无统计学意义(t＝0.775,P＝0.468)。与DMSO组比较,400和200μmol/L RES组中ALP活性明显增高,分别为(6.13±0.22)U/L(t＝17.35,P＜0.001)和(59.93±0.27)U/L(t＝13.57,P＜0.001)。当RES浓度降至100、80、40和20μmol/L时,上清中ALP活性分别为3.73±0.32,3.35±0.54,2.95±0.10和2.72±0.24 U/L,与DMSO组间差异均有统计学意义(t＝5.253,P＝0.002;t＝2.509,P＝0.046;t＝7.066,P＝0.000和t＝2.94,P＝0.026),但10和5μmol/L RES作用后,ALP活性为(1.95±0.14)和(2.0±0.13)U/L,与DMSO组间差异无统计学意义(t＝0.116,P＝0.911和t＝0.013,P＝0.990)(图2)。

图2 白藜芦醇体外对多房棘球蚴原头节ALP活性的影响Fig.2 Changes of ALP activity in E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

2.2 白藜芦醇体外对多房棘球蚴原头节形态的影响 光镜显示,作用至第6 d时,PBS和DMSO组原头节结构完整,透光性良好,大量钙颗粒排列整齐,而40～400μmol/L RES组中原头节活力丧失、透光性降低,并被0.4%台盼蓝染成蓝色,虫体表皮发生大面积溃烂,培养液中有大量小钩散落,且小钩数量随药物浓度升高而增高。然而,10和5μmol/L RES、40μmol/L ABZ-SO、DMSO和PBS组中均未观察到有明显散落的小钩且原头节均未能被台盼蓝着色(图3)。

图3 白藜芦醇体外作用后多房棘球蚴原头节的形态变化Fig.3 Morphological changes of E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

扫描电镜观察显示,在PBS和DMSO组中,顶突外翻原头节的小钩排列整齐,腹部吸盘结构完整,体表被覆有大量微绒毛。40μmol/L ABZ-SO作用后,原头节除体表产生空泡外,体壁无其它显著变化,排泄孔结构清晰;而40μmol/L RES作用后,原头节顶突、吸盘和体壁等基本结构完全被破坏殆尽。透射电镜观察表明,PBS和DMSO组中原头节体壁超微结构完整,例如合胞体层被覆大量向外生长的微绒毛,并被一层过碘酸雪夫染色阳性(Periodic acid-Schiff stain,PAS)物质包绕,内部可见纤维束、肌肉束和圆形或椭圆形的实质细胞等。40μmol/L ABZ-SO治疗组中,原头节合胞体层和PAS物质层变薄、微绒毛变短变少,而RES作用后,原头节基本结构完全被破坏,包括合胞体层、PAS物质和微绒毛明显缺失,实质细胞皱缩,胞浆内可见大量空泡与凋亡小体(图4)。

图4 白藜芦醇体外作用后多房棘球蚴原头节超微结构的变化Fig.4 Ultrastructural alterations in E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

2.3 白藜芦醇体外对多房棘球蚴微囊的作用效果光镜显示,DMSO组多房棘球蚴微囊的角质层和生发层结构完整,透光性良好,内有大量新生原头蚴。40μmol/L ABZ-SO作用2周后,微囊发育较DMSO组迟缓,角质层和生发层形态未发生显著变化,但40μmol/L RES作用后,微囊透光性明显降低,微囊生发层皱缩并与角质层分离(图5)。

化学发光法检测表明,40μmol/L ABZ-SO体外作用后,培养上清中ALP活性为(2.29±0.14)U/L,与DMSO组(2.08±0.09)U/L间差异无统计学意义(t＝1.271,P＝0.273),而40μmol/L RES作用后ALP活性增高,为(2.74±0.15)U/L(t＝3.83,P＝0.019)(图5)。

图5 白藜芦醇体外对多房棘球蚴微囊的作用效果Fig.5 Effect of RES on E.multilocularis microcysts in vitro

3 讨 论

多房棘球蚴好寄生于人类和高原鼠兔等中间宿主的肝脏(占97%以上),严重威胁着人体健康与畜牧业发展[4,14]。目前,AE患者经临床药物ABZ治疗后复发率高,ABZ口服吸收差且长期服用副作用严重等,严重限制了其药效的进一步发挥[15-16]。因此,寻找新型有效的杀虫药物来预防和治疗多房棘球蚴病成为当前的研究热点。

RES常被认为是一个多靶点化合物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗寄生虫等多种生物学作用[9,12]。报道显示,RES能通过下调表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)和胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF-1)等多个信号抑制癌细胞的增殖与转移[8-9]。另外,RES可促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1-α的表达进而缓解血吸虫感染引起的小鼠肝脏纤维化[10],还能下调转化生长因子(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)信号表达改善博来霉素诱导的大鼠肺脏纤维化[17]。肝纤维化是AE致病的关键环节,且上述的信号通路在多房棘球蚴的免疫逃逸、侵袭性增殖与转移过程中均起着重要作用[14,18]。因此,本实验探讨了RES体外对多房棘球蚴PSCs和微囊生长发育的影响,希望为RES在AE治疗中的应用提供依据。

本实验发现,RES体外对多房棘球蚴原头节具有明显的抑制作用,且呈时间、剂量依赖性。RES(400μmol/L)作用24 h后原头节死亡率可达100%,当RES浓度降至40μmol/L时,原头节在第6 d全部死亡,但在等条件下,ABZ-SO(40μmol/L)作用后原头节死亡率仅为(13.25±2.83)%,可见,等量的RES杀虫效果明显优于ABZ-SO。另外,ALP含量常被认为判断多房棘球蚴受损伤程度的重要指标[16],本实验发现,多房棘球蚴原头节培养上清中ALP活性随着RES作用浓度的增高而升高,且等浓度的RES作用后上清中ALP活性较ABZ-SO高,进一步支持了RES杀虫效果比ABZSO更佳。此外,原头节表皮与其营养摄取(葡萄糖等)和免疫逃逸等密切相关[14],而本实验中,RES能破坏其表皮结构,因此,RES杀虫作用可能与IGF-1信号通路下调有关,有待深入研究。

在多房棘球绦虫生活史中,原头节具有双向发育的潜能,即在终末宿主内进行有性繁殖向成虫发育,在中间宿主内进行无性类肿瘤样侵袭性增殖[19]。原头节寄居于人类肝脏的早期,以单个囊泡(微囊)形式存在,即外层为薄的角质层和内被覆的生发层(含大量的贮糖细胞、贮脂细胞和未分化或分化的实质细胞等),并向外以出芽方式呈侵袭性生长,其内部可新生大量的原头蚴,进而形成典型的多囊结构[4,19]。本实验体外模拟了多房棘球绦虫原头节的早期发育过程,即在含饲养细胞(HepG2)的体系中培养至第4周,原头节发育成含角质层和生发层的单微囊,待第6周微囊内有大量新生原头蚴,与Wang的发现类似[4]。ABZ-SO作为ABZ杀虫的活性成分,作用2周后微囊的生长发育受到抑制(体积缩小和发育迟缓等),进一步佐证了ABZ可限制多房棘球蚴的出芽生长[20]。已有研究表明,RES可抑制TGF-β1的表达发挥抗纤维化作用[17],而TGF-β1信号通路在原头节的增殖与微囊的发育过程中发挥着重要作用[20-21]。本实验研究表明,RES体外作用后,微囊活性完全丧失,即生发层皱缩且与角质层分离,其是否与TGF-β1表达下调相关,仍需进一步验证。

RES具有毒副作用小、安全性高的特性,即HK-2和L02细胞分别经RES作用72 h,IC50均大于150μmol/L[22],而 本 研 究 中RES对PSCs的IC50仅约为80μmol/L,且40μmol/L RES的杀虫率也较等浓度的ABZ-SO高,显示RES有一定的成药潜力,但仍需进一步开展体内杀虫效果和细胞毒性等研究。

综上所述,白藜芦醇体外对多房棘球绦虫原头节表现出显著的杀虫作用,对微囊生长发育也具有明显的抑制作用,是潜在的AE治疗药物。

利益冲突:无

引用本文格式:高海军,庞华胜,张妍,等.白黎芦醇体外对多房棘球蚴原头节和微囊的作用研究[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1057-1063.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.157