水稻苗期耐冷种质资源筛选及耐冷性综合评价

程 露 项 阳 逄洪波,* 职铭阳 赵宗耀 金 明 陈 强 郑晓明

(1.沈阳师范大学 生命科学学院,沈阳 110034;2.沈阳师范大学 实验教学中心,沈阳 110034;3.中国农业科学院 作物科学研究所,北京 100081)

水稻是亚洲人口的主粮之一[1-2]，在全球的粮食安全中占有重要地位。我国是水稻大国，据统计，约90%的世界水稻种植和产量均集中在亚洲，其中我国水稻产量约占世界总产量的45%。但水稻属喜温作物，其生长发育的各个阶段均易受到冷害威胁[3-4]。在我国，平均每4～5年就会发生一次大面积冷害，引起水稻大幅度减产甚至绝收[5-6]。故研究水稻耐冷机理、建立方便、精准的耐冷评价体系对于水稻耐冷品种的选育具有十分重要的意义。

近年来，研究人员已经针对水稻苗期耐冷种质资源的筛选做了很多工作。商水根等[7]以苗期存活率为评价指标，从1 542 份核心种质资源中筛选出73 份耐冷性较强的材料；肖宇龙等[8]以苗期叶片的赤枯度作为耐冷性评价指标，从江西省23份早稻中筛选出8 份耐冷性较强的材料；蔡志欢等[9]以死苗率作为评价指标，从230份水稻种质资源中筛选出19份耐冷性较强的材料；王代鑫等[10]以抗坏血酸过氧化物酶活性等4个生理指标为评价指标，从吉林省21份晚熟水稻苗期种质资源中筛选出5份耐冷性较强的材料。这些研究结果表明，苗期叶片的赤枯度、存活率和死亡率等一系列生理指标均可用于苗期耐冷性评价。但耐冷性属于多个因素共同决定的数量性状，仅用某一个或几个评价指标具有一定的局限性，不能精准地鉴定出水稻的苗期耐冷性。故应同时采用形态学指标黄叶率和6个光合生理指标，分别是初始荧光(Fo)、最大荧光产量(Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、原初光能转换效率(Fv/Fm)、叶绿素含量(SPAD)、叶片性能(PI)，以期对水稻苗期耐冷性进行精准鉴定评价。

主成分分析是一种可将多个变量转化为少数几个综合指标(即主成分)的多元统计方法。每个综合指标可涵盖原始变量的绝大部分信息，有效避免了指标间存在的信息重叠[11]，经常与相关性分析、隶属函数法和回归分析等多种统计方法结合使用，目前已应用在水稻和小麦等多种农作物的耐盐和耐旱等抗逆性综合评价中[12-15]。如马帅国等[16]以165份粳稻为材料，以苗高、根长和SPAD值等12个形态学性状作为评价指标，通过主成分分析法、聚类分析和逐步回归分析对苗期耐盐性进行综合评价，筛选出5份耐盐性较强的材料；袁杰等[17]以株高、根长和苗鲜重等6个形态学性状作为评价指标，通过相关性分析和主成分分析结合隶属函数法对42份水稻苗期耐盐性进行综合评价，筛选出5份耐盐性较强的材料；孔宪旺等[18]以20份优异水稻种质资源为材料，以苗高、根长和茎叶鲜重等9个形态学性状为评价指标，通过差异性显著分析等统计学方法，综合评价了苗期耐旱性，筛选出3份耐旱性较强的材料。目前，已对作物的一些抗逆性，如耐盐和耐旱等进行了综合评价，而对水稻苗期耐冷性的综合评价鲜见报道。本研究以52份水稻种质资源作为研究对象，采用人工低温胁迫法，测定其形态学指标黄叶率和6个光合生理指标，应用主成分分析、隶属函数法、聚类分析和回归分析等多种统计方法，对水稻苗期耐冷性进行综合鉴定评价，旨在建立更加精准的耐冷性综合评价体系，以期为培育苗期耐冷品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所选用的52份水稻种质资源由中国农业科学院作物科学研究所提供，分别来自中国、菲律宾、马来西亚、斯里兰卡及日本5个国家。具体品种信息，见表1。

表1 用于本试验水稻品种详细信息Table 1 Details of rice varieties used in this study

表1(续)

1.2 幼苗培养

种子置于50 ℃ 72 h打破休眠后，光照气候培养箱中培养(30 ℃，光照 12 h/黑暗 12 h，光强12 000 lx)至三叶一心后，选取健壮、长势较一致的3盆苗进行试验。试验分为3组，对照组(CK)：放置于人工气候培养箱(30 ℃，光照 12 h/黑暗 12 h，光强12 000 lx)培养；试验A组：放置于人工气候培养箱(10 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光强12 000 lx)进行48 h 低温胁迫后测定生理指标；试验B组：放置于人工气候培养箱(4 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光强12 000 lx)进行24 h 低温胁迫后测定黄叶率。

1.3 生理指标的测定

参考Zhao等[19]的研究，选取低温胁迫前与低温胁迫后2个时间点进行叶绿素含量和叶绿素荧光参数测定，测定位置选取水稻第二叶的中上部，进行3次生物学重复取平均值。

1.3.1叶绿素含量的测定

采用SPAD-502 Plus叶绿素仪(浙江托普仪器公司)进行测定。

1.3.2叶绿素荧光参数的测定

使用英国 Hansatech 公司的pocket PEA 便携式荧光仪测定Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm和PI指标。测定前水稻叶片进行暗适应30 min。

1.4 形态指标的测定

测定4 ℃低温胁迫24 h后幼苗黄叶的数量，叶片发黄超过一半以上则记为黄叶，3次生物学重复。

1.5 数据处理

使用Excel 2010计算原始数据均值，利用SPSS 26.0软件进行相关性分析、主成分分析、聚类分析以及逐步回归分析，相关指标计算公式和方法参考付丽君等[20]的方法。

1.5.1耐冷系数

对于所测得的原始数据进行处理，对照组所测3次生物学重复进行平均值计算，取其平均值；处理组同对照组，取其平均值。

(1)

式中：CTC为52个水稻品种其7个单项指标的耐冷系数，T为试验组中各单项指标低温胁迫后3次测定值的平均值，CK为对照组中各单项指标30 ℃ 3次测定值的平均值。

1.5.2综合指标隶属函数值(U(Xj))

(2)

式中：Xj、Xmin和Xmax依次表示每个试验材料中第j个综合指标值、最小值和最大值。

1.5.3权重(Wj)

(3)

式中：Pj为所有试验材料第j个综合指标的贡献率。

1.5.4耐冷性综合评价值(D)

(4)

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下各指标的相关性分析

由表2可知，在低温胁迫下52份水稻种质资源6个光合生理指标与形态学指标黄叶率之间均呈负相关关系，其中Fo、Fv/Fo、SPAD与黄叶率呈显著负相关，Fm与黄叶绿呈极显著负相关，且相关系数最大，达到-0.416；Fm与Fo、Fv/Fo、Fv/Fm、PI及黄叶率之间均呈极显著正相关，其中与Fv/Fm之间的相关系数最大，为0.823。此外，这些指标之间均呈显著相关关系，导致信息重叠，无法通过这些指标准确的鉴定出水稻的苗期耐冷性，故本研究通过主成分分析法对水稻的耐冷性进行综合评价。

表2 低温胁迫下水稻苗期各指标的相关系数矩阵Table 2 Correlation coefficient matrix of rice seedling indicators under low temperature stress

2.2 主成分分析

由表3可知，主成分1、2、3的特征值依次为3.338、1.602和0.939，均>0.90，且前3个主成分的贡献率分别是47.686%、22.892%和13.412%，累计贡献率高达83.991%，包含了绝大多数信息。因此，本研究选取前3个主成分(CI1、CI2和CI3)，即将最初的7个指标转换成3个相对独立的综合指标对苗期耐冷性进行综合评价。

表3 各综合指标的特征值及贡献率Table 3 Characteristic value and contribution rate of each comprehensive index

由表4可知，在主成分1(CI1)中，Fm、Fv/Fo和Fv/Fm为主要作用因子，其因子载荷分别为0.917、0.940、和0.899；主成分2(CI2)中，Fo、SPAD和黄叶率为主要作用因子，其因子载荷分别为0.743、0.720 和-0.533；而主成分3(CI3)中，Fo、SPAD和PI为主要作用因子，其因子载荷分别为0.492、-0.477 和-0.451。

表4 各综合指标值的因子载荷矩阵Table 4 Factor loading matrix of each comprehensive index value

2.3 水稻苗期耐冷性综合评价

由表5可知，对于同一个综合指标CI1而言，‘东农4号’在10 ℃低温胁迫下的综合指标值(CI1)最大，达到3.598，且对应的隶属函数值U1=1，说明如果将主成分1作为苗期耐冷性评价指标，‘东农4号’品种的耐冷性最强；而‘IRIS 313-15901’CI1值最小，且U1值为0，说明其耐冷性最差。根据各综合指标的贡献率结合公式(3)，求出3个综合指标权重W分别为0.568、0.273和0.160，说明主成分1所占的权重较大。根据公式(4)，求出各品种的耐冷性综合评价值(D)(表5)，且D与耐冷性成显著正相关。

表5 低温胁迫下52个水稻品种的综合指标值(CI)及其权重(W)、隶属函数值(U)、耐冷性评价值(D)及排序Table 5 Comprehensive index value (CI)and its weight (W),membership function value (U),cold tolerance evaluation (D)and ranking of 52 rice varieties under low temperature stress

表5(续)

表5(续)

2.4 聚类分析

根据D，将52份水稻品种进行耐冷性划分为5类，见图1，分别为极强耐冷、强耐冷、中耐冷，弱耐冷及冷敏感。极强耐冷组中是‘合江4号’、‘津原85’和‘东农4号’3份材料；强耐冷分组中有16份材料，分别是‘北稻1号’、‘特青’、‘胜优2号’、‘镇稻2号’、‘京稻21’、‘京花103’、‘富禾99’、‘南粳37’、‘特三矮2’、‘元丰6号’、‘龙粳14’、‘石狩白毛’、‘藤系138’、‘五优稻1号’、‘沈农129’和‘开粳2号’；中耐冷组有26个品种，分别是‘双桂1号’、‘豫籼9号’、‘IRIS 313-11882’、‘IRIS 313-12236’、‘广场13’、‘IRIS 313-11951’、‘扬稻5号’、‘IRIS 313-11885’、‘中花8号’、‘IRIS 313-11866’、‘IRIS 313-11911’、‘IRIS 313-12273’、‘盐粳48’、‘镇籼96’、‘IRIS 313-11929’、‘IRIS 313-12135’、‘IRIS 313-11968’、‘IRIS 313-11986’、‘科砂1号’、‘特优2035’、‘广场矮3784’、‘IRIS 313-12012’、‘珍珠矮11’、‘BG90-2’、‘IRIS 313-11887’和‘马来红’；弱冷寒组有3个品种，分别是‘IRIS 313-11859’、‘临籼22’和‘IRIS 313-11884’；冷敏感组有4份材料，分别是‘IRIS 313-15901’、‘镇稻272’、‘泸红早1号’和‘籼小占’。

Ⅰ，强耐冷；Ⅱ，极强耐冷；Ⅲ，弱耐冷；Ⅳ，中耐冷；Ⅴ，冷敏感。虚线表示欧式距离2.5。Ⅰ,strong cold tolerance;Ⅱ,extremely strong cold tolerance;Ⅲ,weak cold tolerance;Ⅳ,moderate cold tolerance;Ⅴ,cold sensitivity.The dotted line represents Euclidean distance 2.5.图1 基于D的52份水稻种质资源的耐寒性聚类分析Fig.1 Cluster analysis of cold tolerance of 52 rice germplasm resources based on D value

2.5 回归模型建立与苗期耐冷性主要评价指标的筛选

为了进一步确定水稻苗期耐冷性评价指标，以D作为因变量y，7个相关指标作为自变量x，进行了逐步回归分析，回归方程如下：

Y=-0.043+0.244X1+0.208X2+0.100X3+
0.152X4+0.123X5-0.016X6-0.110X7。

式中：X1-7依次代表Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD、PI和黄叶率，方程判定系数R2=1，P=0，7个自变量几乎可决定D的全部变异，由此可见。这7个单项指标与水稻苗期耐冷性显著相关，其中Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm和SPAD共5个指标与其耐冷性呈显著正相关，叶片性能PI和黄叶率与其耐冷性呈显著负相关，可以作为水稻苗期耐冷性的主要评价指标。

3 讨 论

3.1 水稻苗期耐冷指标筛选

植物受逆境胁迫的影响与逆境种类、逆境强度和持续时间等多种因素紧密相连，且与植物种类有关[21-23]。研究表明，低温胁迫对水稻的外部形态特征和生理生化指标均会产生影响[24-28]。形态学指标是一种直接的诊断工具，可以直接反映植物受低温损伤的程度[29-30]。相对于形态学指标而言，生理学指标可进一步反映植物在逆境条件下体内各代谢过程的变化[31-32]，水稻在低温胁迫下会减少叶绿素合成，故叶绿素含量和叶绿素荧光相关的参数通常被作为判断植物耐受逆境胁迫能力的重要指标[25]。本研究选用形态学指标黄叶率并在此基础上结合Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD及PI 6个光合生理指标作为水稻苗期耐寒性的评价指标。

3.2 水稻苗期耐冷性综合评价

植物耐冷特性是一个由多种因素共同调节的复杂机制[33]，仅用单一的某个指标评价植物的耐冷性具有一定的局限性，可能导致结果出现误差。多个评价指标可以从不同方面反映出耐冷性，但多个指标间往往存在一定的相关性，数据出现信息重叠，导致难以正确判断各个指标对于某一性状的影响。应用主成分分析法，可有效消除各项指标之间的相关性，且指标间相关系数越大，分析效果越好。此外，主成分分析可将多个指标转换成相对独立的几个综合指标，且按照方差大小依次排序，通常选择累计贡献率≥80%的主成分，包含绝大部分原始数据信息。如王丽艳等[34]以11份水稻种质资源的种子萌发和幼苗生长指标为耐冷评价依据，唐双勤等[35]以供试的41份水稻种质资源芽期的7个单项指标为耐冷评价依据，通过主成分分析、聚类分析并结合隶属函数值方法对其进行耐冷性综合评价。目前已有的主成分分析研究中，有关水稻苗期耐冷性的研究相对较少，并且由于生理指标的评定工作量大且繁琐，因此绝大多数研究均采用形态学指标，只有少数研究采用生理学指标。本研究选用了形态学指标黄叶率，并在此基础上添加了叶绿素含量和叶绿素荧光参数作为生理指标，以上生理指标可直接通过仪器测定，简便易行，工作量小。已有研究表明，光合作用可反映植物在逆境条件下自身的生长发育状态，叶绿素含量和叶绿素荧光参数的大小可作为植物耐受逆境的生理指标[36]。

3.3 不同水稻品种间的耐冷性差异

本试验基于耐冷性综合评价值(D)将52份种质资源聚类分为5个耐冷等级。其中极强耐冷品种3个，均属于粳稻；强耐冷品种共16份，13份是粳稻；弱耐冷的3个品种与冷敏感4个品种均为籼稻。从结果上看，粳稻的耐冷性普遍强于籼稻，这也与以往的研究结果相一致[29,37]。3个极强耐冷品种‘合江4号’、‘东农4号’和‘津原85’是来自黑龙江省和天津市培育成的品种。同时本研究中有3份籼稻属于强耐冷品种，说明籼稻中也存在较好的耐冷资源，这3份材料是来自广东省的‘特青’、‘胜优2号’和‘特三矮2’。广东省位于中国南部，属亚热带和热带季风气候，其北靠南岭山脉，南临南海，稻区辽阔，从低海拔的潮田到海拔千米的山区梯田都有水稻种植，且很多地区是双季稻。且这3个籼稻品种是早籼稻。这也反映出水稻品种的耐冷性不仅仅是由其自身遗传因素所决定的，还可能与当地种植的习俗有关。

4 结 论

本研究选用形态学性状指标黄叶率，并在此基础上结合Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD及PI等6个光合生理指标，对52份水稻种质资源进行苗期耐冷性鉴定，通过相关性分析，表明低温胁迫下7个单项指标之间存在不同程度的相关性；通过主成分分析，将7个单项指标转换成3个相对独立的综合指标；并结合隶属函数法得到各主成分的权重及52个水稻品种耐冷特性的综合评价值(D)；通过聚类分析将52份水稻种质资源划分成5个耐冷等级；基于D筛选出3份极强耐冷种质资源，分别为‘东农4号’、‘合江4号’、‘津原85’；通过回归分析对水稻苗期耐冷性进行预测，其结果与隶属函数法所得结果相吻合，综合主成分分析和回归分析筛选出的这7个指标可以作为鉴定水稻苗期耐冷特性的可靠指标。