一种来源于葡萄叶片的真菌(Quambalaria cyanescens)的鉴定及培养特性

翟亚伟，赵 颖,2，李胜男，朱妙菲，潘 雯，巴音达拉，马 荣

(1.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆生产建设兵团林业和草原资源监测中心，乌鲁木齐 830002)

0 引 言

【研究意义】吐鲁番地区葡萄产业，占农业总产值的41.27%[1]。近年来在新疆吐鲁番市田间调查过程中，在葡萄病叶上分离得到一株真菌，对比形态学特征和分子生物学数据进行鉴定，对准确鉴定该菌有重要意义。【前人研究进展】Q.cyanescens隶属于担子菌门，黑粉菌亚门，外担菌纲，微座孢目，桉座孢科，桉座孢属，该科仅包含Quambalaria一个属。目前，Quambalaria属中包含9个种：Q.coyrecup、Q.cyanescens、Q.eucalypti、Q.fabacearum、Q.pitereka、Q.pusilla、Q.ruqosea、Q.simpsonii、Q.tasmaniae，模式种为Quambalariapitereka[2-10]。Quambalaria属真菌中既有能够危害桉属(Eucalyptus)和伞房桉属(Corymbia)植物引起幼苗的茎叶、枝干，造成枝叶枯萎、溃烂甚至死亡的病原真菌(Q.eucalypti、Q.fabacearum、Q.pitereka、Q.coyrecup)[11]，又包含能够引发人类腹膜炎等疾病，具有天然的真菌药物抗性，可阻碍抗真菌治疗的Q.cyanescens等临床类病原菌[5]。该属真菌主要分布在澳大利亚、中国、美国、巴西、泰国、荷兰、意大利、葡萄牙、乌拉圭、伊朗、南非、埃及、捷克、马来西亚、土耳其、西班牙、匈牙利、保加利亚、叙利亚等国家[11-15]。目前，我国已经报道了该属中的4个种：Q.cyanescens，Q.pitereka，Q.eucalypti，Q.simpsonii[10，12，16-17]【本研究切入点】从红曲米中筛选得到Q.cyanescens，其发现该菌具有良好的凝乳活性，其产生的凝乳酶是一种新型蛋白[16]。植入物上得到Q.cyanescens[12]，也有研究Q.cyanescens所产凝乳酶的作用[18].。尚未在葡萄叶片上有该属真菌的记录。【拟解决的关键问题】运用常规组织分离法获得纯化菌株，提取该菌基因组DNA，构建系统发育树结合形态学特征完成该菌的分类地位的鉴定。将其接种在不同培养基、温度、pH和光照条件下，混合正交实验，观察并记录该菌的培养特征，分析该菌的最适培养条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

标本来源：2018年在新疆吐鲁番市葡萄园采集获得。

培养基：沙氏葡萄糖琼脂(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和玉米粉琼脂(CMA)，冷却至60 ℃时加入1 mol/L HCl或NaOH溶液微调培养基pH值至特定值后1×105Pa灭菌30 min，试验范围pH 5.0 ～ 9.0，两相邻处理间pH差值为1。

仪器：超净工作台(杭州哈析仪器仪表有限公司)、高压蒸汽灭菌锅(三洋公司GMSX-280)、PCR仪(上海安亭科学仪器厂)、凝胶成像仪(北京盛科信德科技有限公司)、电泳仪(北京市六一机械厂)、体式显微镜(北京荣兴光恒科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 供试菌株的分离、纯化和保存及形态学

常规组织分离法分离2018年在新疆吐鲁番地区采集到的葡萄树病叶，利用单孢纯化法得到纯化菌株。挑取纯化菌株菌落边缘的菌丝置于PDA斜面上，28 ℃黑暗培养，待菌落长至斜面的1/3处时置于4 ℃冰箱保存，每个菌株保存3份。菌株保存于新疆农业大学林学与园艺学院林木保护实验室。

1.2.2 菌株种类的鉴定

1.2.2.1 形态学特征

挑取少量菌落边缘菌丝，置于PDA平板中央的无菌盖玻片边缘，培养3 d后观察并测量盖玻片上菌落的生长情况、孢子的形态结构和培养性状，主要为产生色素的颜色、菌丝质地，并测量其菌落直径。

1.2.2.2 分子生物学的鉴定

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA[19]。通过ITS1(5＇-TCCGTAGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)扩增内转录间隔区；NL1(5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3＇)和NL4(5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇)扩增核糖体大亚基[20-21]。PCR反应体系为30 μL：包含2×EsTaqMaster Mix 15 μL，上下引物各1.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 10.5 μL[22]。PCR产物送至上海生工工程有限公司测序。在GenBank数据库中下载与供试菌株同源性在99%以上物种的ITS和LSU序列，用于系统发育分析。以Microstromajuglandis作为外群，用PAUP*4.0b 10软件进行最大简约分析(Maximum parsimony，MP); 用Raxml软件进行最大似然分析(Maximum likelihood，ML); 用MrBayes 3.2.6进行贝叶斯分析(Bayesian inference，BI)构建系统发育树[23]。表1

表1 Quambalaria属菌株信息Table 1 Quambalaria species information

1.2.3 供试菌株的生物学特性

挑取菌落边缘少量菌丝，采用平板划线法接种分别在不同培养基种类(A)、光照条件(B)、pH值(C)和培养温度(D)等4个因素的不同水平下培养，进行L225(32×52)混合正交试验[24]，设3次重复，3 d后隔日测量菌落直径，计算菌落生长速率。

培养基种类因素3水平：A1、A2、A3分别为PDA培养基、SDA培养基、CMA培养基；光照条件因素3水平：B1、B2、B3分别为全光照、半光照、黑暗；pH值因素5水平：C1、C2、C3、C4、C5分别为pH=5、6、7、8、9；培养温度因素5水平：D1、D2、D3、D4、D5分别为20、25、30、35、40。根据不同处理下的菌落生长速率。

1.3 数据处理

利用SPSS 21.0软件进行多因素方差分析(MANOVA)，判断影响供试菌株生长的主要因素，筛选有利于其生长的最优组合。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的种类鉴定

2.1.1 形态学特征观察

研究表明，从葡萄病叶上得到的菌株Pt4-1在PDA培养基上培养初期菌丝透明稀疏，菌落表面光滑；中后期菌丝白色致密，菌落干燥粗糙，具有明显凸起和丝状边缘；室温培养72 h后可产生紫色色素。培养后期会产生2种分生孢子：初生分生孢子透明，椭圆形至梭形，光滑，大小为3.2～7.3×0.6～2.7 μm；次生分生孢子透明，光滑，卵圆形至椭圆形，大小为2.4～3.4×0.6～1.6 μm。图1

注：A：菌落正面(反面)；B：菌丝(标尺=20 μm)；C：初生分生孢子(标尺=20 μm)；D：次生分生孢子(标尺=10 μm)

2.1.2 分子系统学

研究表明，ITS、LSU引物扩增获得长度约为617 bp和600 bp的基因片段，将所获得的序列同GenBank数据库种的序列进行同源性比较，利用最大简约法(MP法)、最大似然法(ML法)和贝叶斯法(BI法)构建系统发育树。菌株Pt4-1、Pt4-2、Pt6-1、Pt6-2与QuambalariacyanescensBRIP 48396位于同一支，亲缘关系最近。结合形态学特征，最终将供试菌株Pt4-1、Pt4-2、Pt6-1、Pt6-2鉴定为蓝色刺孢霉Q.cyanescens。图2

图2 基于ITS和LSU基因序列的系统发育树Fig.2 phylogenetic tree based on ITS and LSU gene sequences

2.2 菌株的生物学特性

研究表明，菌株Pt4-1在不同的pH值(5、6、7、8、9)、不同培养基(PDA、SDA、CMA培养基)、不同的培养温度(20～40 ℃)及不同的光照条件(全光照、半光照和黑暗条件)下的菌落形态存在较大差异。该菌在PDA、SDA培养基上生长良好，可分泌紫色色素，20～25 ℃的培养温度下紫色色素明显。随着培养温度的升高，色素分泌减少，逐渐由紫色变为蓝色，35 ℃时不产生紫色的色素，40 ℃时菌株不能生长。菌株Pt4-1在CMA培养基上生长但不产生色素。

培养基的种类、光照条件及培养温度三者间的交互作用对菌株Pt4-1菌落生长具有显著影响。菌株Pt4-1在PDA、SDA、CMA培养基上的平均生长速率分别为1.81、1.82、0.86 cm/d；在PDA、SDA培养基上生长速度较CMA培养基更快。不同光照条件、培养基pH值和培养温度对菌落的生长无显著影响。其中组合A2B2C1D2(SDA培养基、半光照、pH5、温度25 ℃)的生长速率最大，平均生长速率为2.29 cm/d；组合A3B2C1D2(CMA培养基、半光照、pH 5、温度25 ℃)的生长速率最小，平均生长速率为0.55 cm/d。图3

图3 Pt4-1在不同培养条件下的菌落形态Fig.3 Colony morphology of Pt4-1 under different culture conditions

3 讨 论

蓝色刺孢霉(Quambalariacyanescens)真菌是一类重要的植物病原真菌，不仅能够危害桉树、桦树[10-11,25]，在伊朗还能够危害葡萄嫩枝[24]，研究首次在新疆的葡萄叶片上收集到菌株Pt4-1，该菌在培养基上形成的初生分生孢子(3.2～7.3×0.6～2.7 μm)为透明、椭圆形至梭形、光滑；次生分生孢子(2.4～3.4×0.6～1.6 μm)透明、光滑、卵圆形至椭圆形，与Narmani和Arzanlou从葡萄藤上得到的Q.cyanescens菌株的形态特征较为相似[26]。

菌株Pt4-1在培养初期时菌丝透明稀疏，菌落潮湿光滑；中后期菌落白色、干燥粗糙、菌丝致密、具有明显凸起和丝状边缘；培养72 h后可观察到菌落背面出现紫色，与Narmani和Arzanlou的研究结果一致[26]。

鉴于该菌在不同培养基上的形成的菌落存在差异，研究观察了菌株Pt4-1在不同培养条件下的培养特征，研究表明菌株分泌色素与培养基种类有关，该菌在CMA培养基上无色素形成，这一结果与Kuan的研究结果一致[9]。但菌株Pt4-1在PDA、SDA培养基上的色素颜色均为紫色至蓝色，与Kuan的描述存在差异。Kuan发现Q.cyanescens在SDA培养基上分泌红色色素、PDA培养基上分泌深棕色色素、果汁琼脂培养基(V8)上分泌紫色色素，引起这一差异的原因有待进一步研究[9]。

色素的产生与否、颜色深浅与培养温度之间存在联系，25～30 ℃时色素产生并多于35 ℃，这与研究相似[9]。

4 结 论

从新疆吐鲁番的葡萄病叶上分离该菌，综合ITS和LSU基因序列分析及菌株的形态学特征确定该菌为蓝色刺孢霉(Quambalariacyanescens)。菌株Pt4-1的最优培养条件为：SDA培养基、半光照、培养基pH值为5、温度25 ℃。