DNA甲基化与2型糖尿病的相关性研究进展

崔凌云，仇鑫，2，周宏宇，李子孝，2，3，4，王拥军，2，3，4

缺血性卒中是我国致死和致残的主要原因[1]。缺血性卒中患者中约有1/3合并糖尿病[2]，其中2型糖尿病占糖尿病总数的90%以上。2型糖尿病是一种多因素导致的复杂疾病，研究发现遗传因素及传统的危险因素仅可以解释约25%的2型糖尿病风险[3]，环境因素与遗传因素之间相互作用的机制——表观遗传学已被证实可以影响2型糖尿病的发病风险[4]。

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分[5]。在真核细胞中，DNA甲基化指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，供体的甲基基团被转移到DNA胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。在发育过程中，基因组的DNA甲基化状态是一个动态变化过程，在许多生物过程中起着重要作用[6]，同时也参与了许多复杂疾病的发病过程。糖尿病通过加速动脉粥样硬化进展促进了缺血性卒中等心脑血管疾病的发生及发展，而DNA甲基化在这一过程中起到了重要的调控作用[7]。对DNA甲基化的深入研究有助于增加对2型糖尿病的认识。本文从DNA甲基化与2型糖尿病的病理生理机制、危险因素、环境因素及并发症等方面的关系展开介绍，对目前研究发现的可能标志物和靶点进行总结，为缺血性卒中的预防提供新思路。

1 DNA甲基化与2型糖尿病的病理生理机制

多项2型糖尿病相关的人类表观遗传病例对照研究发现，人体的血液、胰岛、肝脏、脂肪和肌肉等多种组织和器官中存在与胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗相关的显著差异甲基化表达的基因[8]，这些基因的甲基化改变提示了其与2型糖尿病的相关性。另外，一项大型、前瞻性、巢式病例对照研究还发现，ABCG1和SREBF1等基因甲基化水平的升高以及PHOSPHO1、SOCS3和TXNIP等基因甲基化水平的降低可以预测2型糖尿病的发生[9]。

2型糖尿病的病理生理机制主要为胰岛素抵抗及葡萄糖刺激的胰岛素分泌不足[10]。但胰岛素抵抗本身并不足以导致2型糖尿病的发生，胰岛素抵抗期间胰岛β细胞功能的逐渐丧失即胰岛素分泌受损同样发挥重要作用。有研究发现，2型糖尿病患者胰岛中有853个基因及1649个CpG位点的DNA甲基化水平发生变化，其中，CDKN1A、PDE7B和SEPT9等基因的DNA甲基化水平降低，上述3个基因的过表达均可导致克隆β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少[11]。有研究发现，2型糖尿病患者胰岛中INS、PDX1、PPARGC1A及GLP1R等基因的启动子甲基化水平升高[12-13]。INS基因编码胰岛素；PDX1基因编码Pdx1，Pdx1是一种同源框转录因子，在胰腺发育及β细胞功能维持中起重要调控作用；PPARGC1A基因编码线粒体调节剂；GLP1R基因编码GLP1受体，GLP1受体在激活时会刺激胰岛素分泌并增强β细胞的保护功能，在β细胞功能或细胞代谢中具有重要作用。这些关键基因的表达降低，均与胰岛素分泌受损及胰岛功能障碍相关[14]。HDAC7基因编码组蛋白去乙酰酶HDAC7，基因测序提示在2型糖尿病患者的胰岛中HDAC7基因呈低甲基化改变，这可能导致2型糖尿病患者胰岛中的β细胞功能紊乱，胰岛素分泌受损，同样，大鼠胰岛克隆β细胞中HDAC7的增加会损害线粒体功能和胰岛素分泌[15]，而2型糖尿病HDAC抑制剂givinostat可以修复β细胞中HDAC7过表达出现的胰岛素分泌不足[16]，这为2型糖尿病提供了一种潜在的新疗法。其他一些基因，如NR4A3、PARK2、PID1和SOCS2等，也在2型糖尿病患者胰岛中表现出DNA甲基化和表达水平的变化，与葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损有关[17]。

关于DNA甲基化参与2型糖尿病病理生理机制的研究介绍，一方面，针对胰岛素分泌不足的研究虽然已经有不少成果，但涉及的基因较多，针对性不强，证据不够充足；另一方面，针对胰岛素抵抗的研究目前很少，后续应该重点关注。

2 DNA甲基化与2型糖尿病的危险因素

既往研究报道，与女性相比，男性胰岛的胰岛素分泌功能较差[17]，男性患2型糖尿病的风险高于女性[18]。两性之间存在很大的甲基化差异，且其中＞90%的重要CpG位点都位于X染色体上[17]。与女性相比，男性胰岛中X染色体上约40%的重要CpG位点甲基化程度更高，这可能与较差的胰岛素分泌功能有关。有研究发现，APLN和NKAP基因在女性胰岛中被高度的甲基化抑制，当在克隆β细胞中使用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调Apln和Nkap表达使克隆β细胞具备“女性化”特征时，克隆β细胞胰岛素分泌增多[17]。

年龄是2型糖尿病的危险因素之一。同样，随着年龄的增长，人体组织中DNA甲基化模式发生改变[19]。Fraga等[20]发现，表观基因组在正常年轻同卵双胞胎的细胞中相似，而在正常老年同卵双胞胎中则不同，这支持年龄对DNA甲基化有显著影响的观点。此后许多研究调查了年龄对2型糖尿病重要组织表观基因组的影响，发现正常人体中脂肪、肝脏和血液这3种组织类型的3470个CpG位点的DNA甲基化程度随着年龄的增高发生变化[21]，并且如FHL2、ELOVL2和KLF14等的一些重要CpG位点的甲基化似乎在所有组织中都以相同的方式变化。这些与2型糖尿病紧密相关的组织中的基因甲基化程度随年龄改变的证据可能提示，DNA甲基化在年龄这种危险因素中发挥了一定的作用。一项队列研究分析了87例年龄在26～74岁的非糖尿病患者胰岛的基因组甲基化，发现241个位点的DNA甲基化程度随着年龄的增长而增加，这些位点包含了与2型糖尿病和胰岛素分泌相关的基因[22]。这些研究作为一些间接证据反映了在2型糖尿病相关的组织中存在与年龄相关的DNA甲基化改变，但还需一些直接证据证明年龄作为一种重要危险因素在DNA甲基化与2型糖尿病中发挥的潜在作用。

不同的食物摄入及饮食模式会通过影响DNA甲基化状态来促进2型糖尿病的进展，如叶酸可以提供甲基供体，进入体内后DNMT进一步将这些甲基连接到DNA和组蛋白尾部，实现机体所需的表观遗传调控。研究发现，2型糖尿病患者的叶酸水平降低，且叶酸水平与236个CpG位点的平均甲基化程度呈正相关[23]。动物研究表明，叶酸可改变高脂饮食小鼠脂肪组织中与2型糖尿病相关基因的甲基化水平，降低小鼠的脂肪含量和血清葡萄糖水平，并改善胰岛素抵抗[24]。摄入大量葡萄糖和棕榈酸都会损害葡萄糖刺激的胰岛素分泌。暴露于高水平葡萄糖后，GLRA1、RASD1、VAC14、SLCO5A1和CHRNA5等与胰岛功能相关的基因的表达水平和甲基化程度均发生改变[25]。暴露于高水平棕榈酸酯后，包括TCF7L2和GLIS3在内的290个基因的甲基化水平发生了变化，其中37个基因在2型糖尿病患者的胰岛中差异表达[26]。

肥胖是2型糖尿病重要的危险因素，HIF3a编码一种转录因子，调节机体对缺氧的适应性反应。Rönn等[27]发现肥胖与2型糖尿病患者包括FTO、TCF7L2和IRS1在内的几个候选基因的甲基化存在相关性。

糖尿病的危险因素很多，除了上述提到的以外，2型糖尿病还存在如种族、吸烟和静坐生活方式等多种危险因素，但DNA甲基化相关的研究在这些方面涉及较少，需要后续进一步的关注。

3 DNA甲基化与2型糖尿病的环境因素

2型糖尿病涉及的环境因素包括子宫内环境和母体环境暴露[28]。宫内生长受限对个体调控胰岛和外周组织中葡萄糖和能量稳态的基因表达具有深远的影响。各种原因导致的胎儿宫内生长受限会增加罹患糖尿病的风险，DNA甲基化在其中发挥了一定的作用。Thompson等[29]分离了在胎儿时期暴露于宫内生长受限模型的成年雄性大鼠的胰岛，发现了1400个差异甲基化位点，其中多数差异甲基化CpG位点位于保守的基因区域，且靠近先前被发现为胰岛β细胞生理过程（如细胞分裂和死亡、血管形成和胰岛素分泌）关键调节因子的基因，提示这些差异甲基化CpG位点的功能与胰岛β细胞功能可能相关。在表观基因组关联研究中，胎儿时期处于母体2型糖尿病的成年人被发现存在包含29个基因和10个基因间区域的48个差异甲基化CpG位点[30]，其中一些位点的甲基化改变会损害胰岛素分泌并增加成年后患2型糖尿病的风险[31]。

母体环境暴露同样会增加后代罹患2型糖尿病的风险。邻苯二甲酸酯是常用的增塑剂，添加于多种日常用品中，但因其存在的健康隐患，正在被美国和欧盟多个国家淘汰。母体经常暴露于邻苯二甲酸酯，后代的葡萄糖转运蛋白4基因甲基化程度增高，表达下降，而这种基因编码的葡萄糖转运蛋白4在葡萄糖的摄取和代谢过程中发挥着重要作用。双酚A是一种广泛用于制造聚碳酸酯塑料的环境激素，母体大鼠在整个妊娠和哺乳期间暴露于双酚A会导致后代小鼠整体甲基化水平降低、编码DNMT 3B的基因表达增加[32]，这些变化与成年后代发生胰岛素抵抗有关。

4 DNA甲基化与2型糖尿病的并发症

4.1 动脉粥样硬化性心血管疾病 动脉粥样硬化性心血管疾病是2型糖尿病最常见的大血管并发症，也是糖尿病患者重要的死亡原因[33-34]。以血管平滑肌细胞增殖和积累失衡为核心的新生内膜增生，导致了动脉粥样硬化和狭窄等病理改变，这是糖尿病患者发生动脉粥样硬化性心血管疾病的病理基础。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）是肿瘤增殖和转化的关键介质，在糖尿病中发挥重要作用，组织因子通道抑制因子2（recombinant tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）是血管平滑肌细胞增殖和迁移的组织因子途径抑制剂。研究发现在糖尿病小鼠模型中，PARP1作为负调控因子增加了TFPI2启动子的DNA甲基化水平，下调TFPI2表达，进而加速主动脉新生内膜的增生[35]。大血管的动脉粥样硬化改变是联系2型糖尿病与缺血性卒中的关键病理变化，未来还需更多的临床队列及基础研究来探索DNA甲基化在其中的作用。

4.2 糖尿病肾病 糖尿病肾病（d iab etic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症，2型糖尿病患者中约有40%会发展为DKD[36]。DKD的特征是细胞外基质蛋白在肾内聚，引起肾小管间质纤维化等一系列病理变化，导致肾功能障碍[37]。UNC13B基因被认为介导了高血糖导致的肾小球细胞凋亡，与DKD的发病及进展相关，与健康人相比，在糖尿病患者中发现了包括UNC13B基因在内的多个基因的差异甲基化[38]。DKD患者长期暴露于高血糖环境会诱导包括转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在内的多种细胞因子的产生。在TGF-β1诱导的肾纤维化模型中发现，TGF-β1的上调可诱导Rasal1启动子的高甲基化，导致Ras-GTP抑制因子的表达减少，Ras-GTP信号传导增加，成纤维细胞活化增加，纤维化加速[39]。有研究提议可以使用DNA甲基化谱作为生物标志物帮助预测2型糖尿病患者DKD的进展，但还需进一步的临床验证。

4.3 糖尿病视网膜病变 糖尿病视网膜病变是2型糖尿病常见的微血管并发症之一，也是成年人失明的主要原因。有研究发现，糖尿病患者视网膜及其毛细血管细胞中的MMP-9水平升高，损伤线粒体，进而加速视网膜毛细血管细胞凋亡，这是发展至视网膜病变前的一种病理现象[40]。一项基于糖尿病小鼠模型的研究发现，尽管高糖状态促进了DNMT1与MMP-9启动子的结合，促进基因表达，但在相同的启动子位点，去甲基化酶Tet2结合同期增加，抑制了基因表达，最终结果为MMP-9启动子甲基化水平降低，去甲基化水平升高，MMP-9表达增加。这提示在高糖状态时，MMP-9的表达由活跃的DNA甲基化-去甲基化过程控制，调节该机制可能有助于维持线粒体稳态并抑制糖尿病视网膜病变的发展[41]。

5 展望

过去几年涌现了大量关于DNA甲基化与2型糖尿病相关性的研究，证实DNA甲基化可通过多种途径参与2型糖尿病的发生与发展，少数DNA甲基化位点甚至可以预测2型糖尿病的发生。然而，目前这些研究仍主要以横断面研究为主，未来需要更多前瞻性队列中的DNA甲基化数据来挖掘更多具有临床应用潜能的DNA甲基化标志物。全基因组DNA甲基化谱作为一种新兴生物标志物，在未来不仅可用于预测个体患2型糖尿病或2型糖尿病特定并发症的风险，还可以开发包含遗传信息和DNA甲基化的智能化2型糖尿病诊疗系统，针对特定甲基化位点及相关的关键酶也可作为未来药物治疗的靶标，由此开发出更多的创新疗法，为缺血性卒中的一级及二级预防提供更多治疗方法。