动脉粥样硬化性疾病的DNA甲基化改变

伊珞，周宏宇，仇鑫，李子孝，3，4，王拥军，3，4

动脉粥样硬化是缺血性卒中、冠心病的主要致病原因[1]。动脉内膜血流紊乱区域内皮功能障碍和内皮下脂蛋白滞留相互作用，继发炎症，导致血管平滑肌细胞激活、单核细胞募集、细胞内外物质和脂质积聚，动脉粥样硬化斑块形成[2]。斑块破裂和侵蚀（不稳定）引起血栓形成、血管闭塞，造成急性血管事件发作[3]。研究表明，DNA甲基化在动脉粥样硬化发生、发展中具有重要调节作用[4]，动脉粥样硬化患者斑块及外周血细胞中可检测出特定位点或全基因组DNA甲基化水平改变[5]。本文从动脉粥样硬化病理过程、外周血细胞刺激及响应、临床心脑血管事件中DNA甲基化模式展开叙述，以探索有前景的诊疗靶点和标志物。

1 DNA甲基化与动脉粥样硬化斑块的形成及进展

动脉粥样硬化斑块形成与进展的不同阶段表现出细胞特异性DNA甲基化改变，内皮功能障碍、平滑肌细胞可塑性及巨噬细胞极化是DNA甲基化修饰的关键干预靶点[6]。

1.1 血管内皮功能障碍 内皮源性一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化NO产生舒张血管的平滑肌细胞并抑制其增殖[7]，内皮依赖性血管平滑肌舒张异常是血管内皮功能障碍的主要临床评估指标[8]，另外，血管内皮细胞还可通过抗血栓形成、抗白细胞黏附等方式维持血管稳态[9]。

1.1.1 血流动力学依赖性DNA甲基化调节内皮基因表达 局部扰动流及低而往复的切应力可通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）调节内皮细胞基因的表达[10]。有研究显示，低切应力可降低10/11易位甲基胞嘧啶双加氧酶（ten-eleven translocation-2，TET2）表达抑制自噬，进而导致内皮功能障碍[11]。

小鼠体内切应力响应的顺式作用元件Krüppel样因子（Krüppel-like factor，KLF）是eNOS转录的必要成分，血流紊乱区域内皮DNMT1表达增加，诱导一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）基因启动子内位点高甲基化，引起eNOS表达下降[12]。DNMT1表达沉默可抑制小鼠结扎颈动脉的内皮细胞中增殖标志物（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）等炎症因子表达[13]。小鼠血管内皮细胞切应力敏感性差异性甲基化位点中同源异型盒A5（homeobox protein A5，HoxA5）基因和KLF3受DNMT1调节[10]，但是有研究显示上述差异性甲基化位点与人类心血管疾病发病风险是否相关尚不明确[14]。

DNMT3A在扰动流诱导下富集于内皮细胞，引起KLF4启动子内位点高甲基化导致KLF4转录抑制与表达降低，下游NOS3和血栓调节蛋白（thrombomodulin，THBD）基因表达受到抑制引起血管舒张和抗凝功能受损，单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）基因表达增加诱发内皮炎症[15]。

1.1.2 动脉粥样硬化危险因素通过DNA甲基化修饰介导血管内皮舒张功能障碍 冠心病患者血流介导血管舒张功能（f l o wmediated dilation，FMD）与p66shc启动子甲基化程度呈正相关，S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAH）可通过DN M T1介导小鼠主动脉内皮细胞p66shc启动子中位点低甲基化，上调p66shc表达并通过氧化应激引发内皮舒张功能障碍[16]。

氧化型低密度脂蛋白（oxidation low lipoprotein，ox-LDL）可上调DNMT3B表达，诱导E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG）基因启动子内多个位点高甲基化，降低CREG表达，导致磷酸化eNOS水平降低，引起内皮舒张功能障碍[17]。

研究结果表明，血液中Hcy、脂质相关代谢产物等动脉粥样硬化危险因素可通过DNA甲基化修饰介导内皮功能舒张障碍从而诱发并加重动脉粥样硬化，应用去甲基化药物和代谢抑制治疗则可有效改善内皮舒张功能，辅助动脉粥样硬化性疾病的临床治疗。

1.2 平滑肌细胞激活、增殖与表型转换 平滑肌细胞在动脉粥样硬化斑块形成早期发生迁移、克隆性增殖和表型转换，导致病理性动脉内膜增厚，促进斑块周围炎性环境形成[18]。人类动脉粥样硬化斑块中TET2和5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）含量下降，TET2基因敲除可导致平滑肌收缩标志物表达减少和KLF4表达增加[19]，平滑肌细胞KLF4敲除则可有效缩小小鼠动脉粥样硬化斑块体积[20]。

平滑肌细胞增殖引起的血管重塑是动脉粥样硬化的中间病理改变[21]。DNMTs基因敲除或抑制引起TET2基因启动子内高甲基化丧失，促进其表达，从而抑制小鼠体外血管平滑肌细胞的增殖、迁移和去分化，从而延缓血管重塑[22]。DNMT1抑制诱导磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因启动子低甲基化，促进其表达，从而增强平滑肌分化改善血管重塑[23]。血管重塑导致细胞核局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）活化以及由细胞核向细胞质定位，增加DNMT3A表达和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）水平，提高收缩基因启动子DNA甲基化水平从而减少其表达，导致平滑肌细胞向去分化以及合成的表型转换[24]。

1.3 单核细胞募集与巨噬细胞极化 动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞源于血液中单核细胞的募集、分化和增殖[25]，炎症消退能力受损是动脉粥样硬化进展的重要原因[26]，主要由巨噬细胞不成比例的极化驱动[27]。

人类颈动脉斑块中信号淋巴细胞激活分子家族成员7（signaling lymphocytic activation molecule 7，SLAM7）基因启动子低甲基化，SLAM7表达增加且集中于富含CD68+的巨噬细胞[28]，与M1极化表型引发和维持炎症、表达CD68+并分泌促炎因子的特征相符[29]。

DNMT1可提高小鼠斑块巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）基因启动子内位点甲基化水平，促进巨噬细胞活化及斑块进展[30]。DNMT1在人类和小鼠颈动脉斑块中表达均增加，引起KLF4启动子内位点甲基化水平升高，抑制KLF4表达，从而使巨噬细胞向“促炎”表型转换[31]。TET2失活导致NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体活性增强，促进炎性因子产生[32]。

动脉粥样硬化斑块中的多种细胞响应表型调节，了解细胞特异性DNA甲基化及表达改变有助于理解细胞功能，探索干预靶点。

2 动脉粥样硬化性疾病的外周血DNA甲基化

外周血白细胞参与免疫反应，使得血液中炎症因子、脂质等成分可以调节动脉壁细胞反应[26]。由于动脉粥样硬化斑块取材的局限性，目前研究主要以外周血为样本，分析外周血DNA甲基化相关研究有助于系统理解动脉粥样硬化性疾病。

2.1 DNA甲基化在白细胞亚型中的改变 有研究显示，急性心肌梗死患者外周血淋巴细胞内胆固醇含量高、外排减弱，炎症因子及硫酸基转移酶2B1b（sulphotransferase 2B1b，SULT2B1b）基因表达增加，SULT2B1b启动子甲基化比例以及DNMT3A、DNMT3B表达水平低于健康人群，提示SULT2B1b启动子低甲基化可降低SULT2B1b转录，并导致淋巴细胞内胆固醇积累伴炎症加重以及冠心病进展[33]。

AT丰富结构域5B基因（AT-richinteractive domain 5B，ARID5B）内cg25953130位点甲基化水平与表达呈负相关，ARID5B敲低导致脂质代谢和炎症反应基因表达下降，从而抑制单核细胞迁移和吞噬[34]。叶酸可拮抗高同型半胱氨酸血症和高脂血症引起的全基因组DNA低甲基化和ARID5B高表达，抑制单核细胞分化[35]。冠心病患者外周血中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5-mC水平较健康人群降低，但仅在单核细胞中有显著差异，伴5-hmC增加和DNMT1表达下降[36]。

冠心病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中5-mC和5-hmC水平与颈动脉和冠状动脉粥样硬化水平呈正相关[37]，TET2表达显著增加[38]，巨噬细胞极化相关基因位点内具有明显的甲基化水平差异[39]，提示单核细胞DNA甲基化与动脉粥样硬化性疾病间的关系需进一步研究。

2.2 外周血全基因组中的DNA甲基化特征DNA甲基化水平改变与动脉粥样硬化病变程度有关，其差异性位点多出现于炎症、氧化应激、糖代谢等反应途径。高血压患病率高的非洲裔美国人外周血白细胞全基因组DNA中4个甲基化位点与未来多部位动脉粥样硬化相关[40]。动脉粥样硬化患者外周血白细胞中N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，m6A）水平与颈动脉斑块的大小和厚度呈负相关，与α-酮戊二酸/铁依赖性双加氧酶同源蛋白1（AlkB homolog 1，ALKBH1）基因表达上调有关[41]。冠心病患者IL-6基因启动子特异性位点甲基化水平降低，IL-6mRNA表达增加[42]。早发性颅内动脉粥样硬化性狭窄患者外周血白细胞中差异性甲基化位点与炎症、糖代谢等过程有关，其中环指蛋白213（ring finger protein 213，RNF213）基因内cg22443212位点具有显著高甲基化水平，该基因调节血管壁发育并与免疫和炎症相关[43]。

全表观基因组关联研究（epigenomewide association studies，EWAS）有助于判断特定基因DNA甲基化模式与发病风险间的关系[44]，相关差异甲基化位点可作为评价靶点[45-46]。线粒体DNA拷贝数（mtDNA-C）可能通过修饰细胞核DNA甲基化调节核基因表达影响心血管疾病发病机制[47]。有研究表明，芳香烃受体抑制因子（aryl hydrocarbon receptor repressor gene，AHRR）基因启动子上游的差异甲基化区域与多个社区人群队列的颈动脉内膜厚度相关[48]。颈动脉斑块患者外周血Smad家族因子7（Smad family member 7，SMAD7）基因启动子内位点甲基化水平较高，且与颈动脉斑块评分呈正相关[49]。有研究表明，脂质可引起血液细胞DNA甲基化改变，但尚未观察到DNA甲基化调节血脂水平的证据[50]。

外周血特定白细胞亚型中差异表达的基因可能在局部斑块形成、血液物质代谢、系统炎症反应中起重要作用，然而DNA甲基化调节可能改变循环系统中细胞的数量和比例，全血样本细胞异质组成可影响检测结果。因此，单细胞测序技术可能有助于探索动脉粥样硬化病因，补充其发生发展的时间和空间机制，其与EWAS的结合需进一步探索。

3 大动脉粥样硬化型卒中与DNA甲基化改变

大动脉粥样硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）型卒中是缺血性卒中的主要亚型[51]，尽管未观察到缺血性卒中亚型间全基因组DNA甲基化水平的显著差异[52]，但是LAA相关DNA甲基化改变已被报道。

3.1 炎症与氧化应激 LAA型卒中急性期外周血MTRNR2L8基因启动子周围差异性甲基化位点低甲基化，该基因编码多肽分子，具有神经保护、抗凋亡及抗炎作用，其甲基化水平对预后具有预测作用[53]。动脉粥样硬化性卒中及TIA发作患者外周血单核细胞、B细胞及T细胞中自身免疫调节蛋白1（autoimmune regulator type 1，AIRE1）和花生四烯酸12-脂加氧酶（arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12）启动子甲基化水平升高，其中单核细胞中基因甲基化程度显著低于B、T细胞，提示单核细胞在动脉粥样硬化发展的炎症机制中可能发挥更重要的作用[54]。卒中急性期患者外周血白细胞中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）基因甲基化水平显著降低，可能与中性粒细胞炎症和氧化应激途径有关[55]。

3.2 血脂代谢 LAA患者外周血细胞DNA中甲基化差异性位点与脂代谢相关[56]。缺血性卒中患者外周血白细胞中ATP结合盒转运体蛋白G1（ATP-binding cassette G1，ABCG1）基因启动子内位点高甲基化，且在女性中更为显著[57]。全血细胞总DNA中载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因启动子内位点高甲基化与我国汉族人群动脉粥样硬化性卒中有关[58]。动脉粥样硬化性卒中患者外周血白细胞microRNA223基因启动子内9个位点甲基化水平低于健康人群，且与血TG水平呈正相关[59]。

3.3 斑块不稳定 动脉粥样硬化性卒中患者MMP24基因cg04316754位点在不稳定斑块（溃疡斑块）中甲基化程度较在稳定斑块中更高[60]。相比未发生急性血管事件的颈动脉斑块患者，卒中或TIA患者颈动脉斑块中脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）编码基因PLA2G7启动子甲基化水平显著降低，Lp-PLA2表达增加[61]。

3.4 二级预防药物疗效 卒中后阿司匹林治疗期间复发患者镁依赖性蛋白磷酸酶1A（protein phosphatase magnesium dependent 1A，PPM1A）基因内cg04985020位点具有较高的甲基化水平[62]。卒中后氯吡格雷治疗期间复发患者肿瘤坏死因子受体相关因子3（tumor necrosis factor receptorassociated factor 3，TRAF3）基因内cg03548645位点DNA甲基化水平显著降低，且与CYP2C19基因型无关[63]。CYP2C19*1/*1型卒中患者ATP结合盒转运蛋白家族b亚家族成员1（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）低甲基化与较低药物吸收率、较高血小板反应性以及缺血事件风险增加有关[64]。

动脉粥样硬化是始于局部斑块的系统性疾病[65]，特异位点及全基因组水平的DNA甲基化改变可能是疾病的原因或后果，且与遗传、环境等多个内外源因素密切相关。由于血管组织学来源、样本细胞组成、局部微环境代谢状态及病变阶段均会影响检测结果，因此迫切需要更多研究提供DNA甲基化水平改变与动脉粥样硬化尤其是临床血管事件发作、进展与治疗、预后之间的关系，以明确DNA甲基化的响应和调节机制，为诊疗提供新的思路。