动物源性食品中抗生素多残留检测的研究进展

孙傲楠，林圣华，赵涛，李晴，刘秀河*

（1.齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东 济南 250353；2.山东省科学院生物研究所，山东 济南 250103）

抗生素是一类天然、半合成或人工合成的化合物，具有抗微生物活性。根据化学结构或作用机制不同，可分为四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类等[1]。抗生素被广泛用于预防和治疗人类或动物由细菌感染而引起的疾病，并作为生长促进剂添加到动物饲料中，促进动物的生长发育、控制繁殖周期和育种性能等[2]。由于部分人工饲养员缺乏专业知识，不合理地使用抗生素，从而导致环境以及动物源性食品中抗生素大量残留。抗生素残留通过食物链进入人体后，可能导致某些器官的功能、神经、肝脏和血液系统受到损害，对儿童、孕妇或肾功能不全的患者危害更大[3]。此外，抗生素残留会诱导抗性细菌和抗性基因的产生，导致对抗菌药物产生耐药性的病原体增加，对公共卫生安全带来较大隐患。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指出，即使是低浓度的抗生素也可以使耐药菌株茁壮成长，动物源性食品中抗生素残留是近几年国际社会普遍关注和研究的问题之一[4-5]。

动物源性食品中抗生素残留分析检验是保障食品安全的重要组成部分，欧盟和食品法典委员会等监管机构规定了最大残留限量（maximum residue limits，MRLs）[6-7]。我国于2020年4月1日起正式实施GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，在该标准中明确规定了四环素类、多肽类、头孢菌素类等抗生素在动物源性食品中的MRLs[8]。随着科学技术的日益发展，高效液相色谱以及液相色谱-质谱设备的普及提高了痕量抗生素多残留检测的准确性和灵敏度。但动物源性食品的基质复杂（包括蛋白质、脂肪、无机盐、糖和重金属离子等物质），严重的基质效应影响高分辨仪器对抗生素残留定性和定量分析的准确性和灵敏度[9]。样品前处理可以减少基质背景物的干扰，纯化样品和预浓缩目标物，并根据检测方法将目标物转化为合适的形式，动物源性食品中抗生素残留检测前处理技术的研究对提高动物源性食品中抗生素残留检测的准确性以及灵敏度至关重要。因此，本文综述近年来动物源性食品中抗生素残留检测中前处理研究的进展，特别是新材料和新方法在解决传统前处理方法存在的弊端方面的应用，对高效、灵敏的动物源性食品中抗生素残留检测方法的研究具有重要意义。

1 抗生素残留分析中样品前处理方法

样品前处理的步骤一般包括取样、提取、净化和浓缩等。样品前处理方法的选择主要取决于样品基质、检测方法和分析物的性质[10]。动物源性食品基质中抗生素多残留检测通常采用基于相吸附原理和相分配原理的样品前处理方法，包括固相萃取（solid-phase extraction，SPE）、基质分散固相萃取（matrix solid-phase dispersion，MSPD）、磁性固相萃取（magnetic solid-phase extraction，MSPE）、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）法等。

2 基于相吸附原理

2.1 固相萃取

高分辨质谱检测仪具有高效和高灵敏等特点，近年来动物源性食品中抗生素多残留检测多采用超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）或液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）[11]。但在仪器分析之前，对样品的纯化和富集有很高的要求，固相萃取技术是样品净化和预浓缩过程中应用最广泛的萃取技术之一[12]。相对于传统的萃取方法（索氏提取法），具有样品处理时间较短、不易出现乳化或起泡等优点，分析物在痕量浓度水平下也有较高的回收率，且易于实现自动化操作。适用于动物源性食品的固相萃取吸附剂，包括C18、石墨化碳黑和二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮（hydrophile-lipophile balance，HLB）固相萃取柱等[13-14]。常规的固相萃取技术在动物源性食品前处理应用中，存在样品提取步骤繁琐、净化不彻底以及处理样品单一等缺点。近年来新型固相萃取吸附剂以及新型固相萃取技术的开发改善了传统固相萃取技术的缺点。

Yan等[15]采用混合型强阳离子交换反相固相萃取柱，对鸡蛋、牛奶和动物组织（肌肉、肾脏、肝脏和脂肪）中的加米霉素进行净化和富集。该方法使用乙腈提取样品，样品提取液经混合型强阳离子交换反相固相萃取柱净化和富集后，采用UHPLC-MS/MS进行检测。实现在 1.0 μg/kg～200 μg/kg范围内，加米霉素的高效、灵敏检测。该方法的最低检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分别为0.30 μg/kg～0.40μg/kg和0.80μg/kg～1.0μg/kg，加标回收率为84.2%～115.9%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于10%。相比于传统的C18、石墨化碳黑和HLB固相萃取柱，新型阳离子交换反相吸附剂能够简化样品提取步骤，提高动物源性食品中加米霉素分析效率，该方法适用于快速筛选鸡蛋、牛奶和动物组织中是否存在加米霉素残留。Shen等[16]采用QuEChERS/96孔SPE平板法提取鱼肉样品中的糖肽类抗生素（万古霉素和去甲万古霉素），并通过UHPLC-MS/MS进一步分析。对阳离子交换树脂吸附剂、萃取剂中乙腈的比例、流动相水/乙腈等参数进行优化。在最佳条件下，LOD和LOQ 分别为 0.51 μg/kg和 1.73 μg/kg，日内和日间精密度分别小于5.19%和6.30%，回收率为86.7%～98.6%。该方法结合QuEChERS法和酶联免疫检测的优势，实现了动物源性食品中抗生素的高通量、多残留的检测，满足万古霉素和去甲万古霉素的日常监测要求。Lu等[17]通过直通式固相萃取净化程序去除脂肪和磷脂等基质背景物，并结合UHPLC-MS/MS实现鸡肉和鸡蛋样品中11种喹诺酮类抗生素的检测。样品用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取液，以释放和提取目标物。鸡肉样品的回收率为70.4%～98.4%，鸡蛋样品的回收率为66.9%～99.0%，检测下限为0.1 μg/kg～0.16 μg/kg。该方法成功应用于60份鸡肉和110份鸡蛋样品中11种喹诺酮类抗生素残留的筛查。

SPE技术在复杂的基质或含有多种不同性质的抗生素样品处理中，存在特异性、效率较低且吸附剂的微孔结构会被样品中固体颗粒或胶体物质堵塞等缺点，导致样品净化不完全[18]。为了进一步改进，在SPE技术的基础上，分子印迹聚合物固相萃取（moleculary imprinted polymer solid-phase extraction，MIP-SPE）[19]、基质分散固相萃取（matrix solid-phase dispersion，MSPD）[20]、磁性固相萃取（magnetic solid-phase extraction，MSPE）[21-22]、固相微萃取（solid-phase micro extraction，SPME）[23]等技术逐渐被应用。

2.2 分子印迹聚合物固相萃取

MIP-SPE中的分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）是将印迹分子、功能单体与交联剂聚合作为模板分子的目标分析物，通过洗涤或化学键断裂保留MIP中的结合位点，留下特异的识别位点。MIP模拟“抗体-抗原”的作用机理，通常被用作固相萃取中选择性吸附材料[24]。

Feng等[25]以四环素为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，合成了四环素印迹聚合物。建立了MIP-SPE结合高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定动物源性食品中四环素类抗生素残留的方法。制备的固相萃取柱具有高吸附容量（3 560 ng～4 700 ng）和高回收率（＞87%）等优点。该方法同时分析3种动物源性食品中4种四环素类抗生素残留，具备纳克级别的超灵敏检测限，LOD和回收率分别为20 ng/g～40 ng/g和 74%～93%。Baeza等[26]制备了能够同时识别6种头孢菌素的MIP作为分子印迹固相萃取吸附剂，利用MIP-SPE提取目标物并结合UHPLC-MS/MS建立在牛奶样品中测定头孢硫呋、头孢唑林、头孢喹肟、头孢匹林、头孢氨苄和头孢噻吩等抗生素多残留检测方法。该方法的 LOD 为 1.7 μg/kg～12.5 μg/kg，远远低于牛奶样品中头孢菌素类抗生素的MRLs。相对于传统的MIP-SPE只针对模板分子的特异识别的缺点，该方法开发的新型MIP能够同时对6种头孢菌素类抗生素进行分析测定，拓宽了MIP-SPE在动物源性食品抗生素残留分析中的应用。Yang等[27]采用MIPSPE结合LC-MS/MS同时测定蜂蜜、牛奶和猪肉样品中潮霉素、链霉素、阿米卡星和帕罗霉素等11种氨基糖苷类抗生素。采用50 mmol/L磷酸二氢钾提取蜂蜜样品中的氨基糖苷类抗生素，采用含有2%三氯乙酸、10 mmol/L磷酸二氢钾和0.4 mmol/L乙二胺四乙酸二钠组成的溶液，提取牛奶和匀浆肉类样品中的氨基糖苷类抗生素。提取物采用分子印迹固相萃取柱净化。该方法成功应用于3种不同基质的样品，LOD为2 μg/kg～30 μg/kg，LOQ 为 7 μg/kg～100 μg/kg，平均回收率为78.2%～94.8%。

新型MIP克服了传统SPE吸附剂单一目标物特异性强的缺点，具备更高的负载量和选择性，可以实现结构相似的一系列目标物的识别，提高了样品的处理能力。传统分子印迹固相萃取剂正向高负载量、选择性、生物相适性以及重现性和稳定性方向发展。

2.3 基质分散固相萃取

传统色谱分析法要求样品及成分以无黏性、无颗粒和相对均匀的液体进入色谱柱的顶部，但是大多数动物源性食品组织，特别是肌肉和器官组织并非排列均匀[28]。MSPD适用于大量固体、半固体或高黏性生物样品的制备和提取[29]。在MSPD过程中，将样品与黏结相或其他固体支撑材料一起研磨，然后将得到的混合相作为装柱的填料。

Kim等[30]开发MSPD结合LC-MS/MS同时测定肉类、牛奶和鸡蛋中20种氨基糖苷类抗生素的分析方法。使用乙酸铵缓冲溶液和分散固相吸附剂（C18）对样品进行净化和富集，得到的线性相关系数良好（r2＞0.98），平均回收率和精确度为70%～118%和1%～27%。该方法提供了筛选和定量多种食品基质中20种氨基糖苷类抗生素残留的方法。Huang等[31]基于MSPD结合UHPLC-MS/MS同时测定猪肉中15种β-内酰胺类抗生素，同时针对动物源性食品的基质效应进行研究。该方法采用己烷淋洗肌肉组织和Oasis HLB吸附剂组成的萃取柱，然后用乙腈洗脱，将提取液用于UHPLCMS/MS分析。结果表明，基质匹配校准曲线的相关系数均高于0.99，RSD小于12%，β-内酰胺类抗生素的LOD 和 LOQ 为 0.02 μg/kg～0.63 μg/kg 和 0.07 μg/kg～0.97 μg/kg，平均回收率为92%～111%。该方法已成功应用于中国猪肉市场中15种β-内酰胺类抗生素的检测。

MSPD简化了传统样品前处理过程中组织细胞裂解、均质、提取和净化等多个步骤并将样品分散成较小的颗粒，为之后目标物的分析提供了更大的表面积。MSPD避免了有机溶剂的消耗，具有简单性、灵活性和低廉性等优点[32]。但是，MSPD技术实现自动化操作较为困难，方法不易标准化应用[33]。

2.4 磁性固相萃取

MSPE是一种以磁性纳米粒子为改性吸附剂的新型固相萃取技术[34]。磁性吸附剂主要由磁性无机材料（如磁铁矿、磁赤铁矿等）和非磁性材料（有机和无机分子、聚合物等）组成。在磁场作用下，磁性纳米粒子可以实现目标分子与样品基质的高效分离以及富集，极大地简化了萃取过程，提高了萃取性能[35]。MSPE因其具有吸附效率高、操作简便、分离速度快、省时、成本低等优点而受到了广泛关注。

Zhao等[36]采用分步水热法合成了一种基于二硫化钼基核壳磁性纳米复合材料（Fe3O4@MoS2）的磁性吸附剂，并结合HPLC-MS/MS；用于牛奶、猪肉和鱼肉中磺胺类抗生素的分析；系统地研究了萃取参数，其中包括酸碱度、Fe3O4@MoS2的用量、萃取时间、温度和解吸条件；在1.0 ng/L～1 000 ng/L线性范围内，LOD为0.20 ng/L～1.15 ng/L，回收率为85.50%～111.5%，相对于传统的磁性纳米粒子，合成的Fe3O4@MoS2复合材料对磺胺负载量的提取效率明显提升。Ye等[37]合成了一种新型高氟硼吸附剂（fluoride boron adsorbent，FBA），用作 MSPE的萃取相，并将FBA/MSPE与高效液相色谱-二极管阵列检测（high performance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD）联用，定量分析环境中的水和牛奶样品中的痕量喹诺酮类抗生素。此方法展现了良好的线性关系和精密度，其中水样品和牛奶样品LOD 为 0.004 9 μg/kg～0.016 0 μg/kg 和 0.010 μg/kg～0.046 μg/kg，回收率分别为 80.1%～120%和 78.9%～119%。所建立的FBA/MSPE-HPLC/DAD方法适用于测定水和牛奶样品中的痕量喹诺酮类抗生素。

2.5 固相微萃取

SPME是一种采用熔融硅质纤维涂覆固定相或内涂层，基于固定相-水相之间达到分配平衡控制来吸附、预浓缩样品中的目标物，可应用于液体、固体和气体样品的无溶剂样品前处理技术[38-39]。由于其独特的微型装置设计，具备操作简便、有机试剂消耗量少等优点。此外，SPME可以与气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳仪等大型仪器实现在线联用，并且能够实现完全自动化操作。在线联用的检测模式能够简化检测步骤，减少人为处理导致的误差，实现小样本食品的快速高效检测[40]。Sadeghi等[41]建立基于SPME和聚离子液体膜吸附剂对分析物预浓缩，然后使用铜纳米团簇（Cu NCs）进行分子荧光光谱测定牛奶和蜂蜜中磺胺噻唑的新方法。在吸附和解吸的最佳条件下，线性浓度为 0.13 μg/mL～25.5 μg/mL，LOD 和 LOQ 分别为0.07 μg/mL和0.23 μg/mL，牛奶和蜂蜜样品中磺胺噻唑的回收率分别为84.5%～104%和96.6%～107%。该方法通过固相微萃取结合荧光快速分析，极大缩短了检测时长，可以用日常监管过程中大批量样品的抗生素残留筛选。

2.6 QuEChERS法

Anastassiades等[42]引入了一种快速、简单、廉价、有效、耐用和安全的快速样品前处理技术，即QuEChERS法。QuEChERS法基于盐析效应，通常包括盐析溶剂萃取和分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）净化等步骤[43]。QuEChERS法可以从样品基质中去除水和不需要的基质组分，有效消除基质效应并获得目标分析物良好的回收率，具有高重现性和稳定性，更符合绿色分析化学原则。

Zhou等[44]将响应面法优化的QuEChERS法与HPLC-MS/MS相结合，同时分析牛奶中16种大环内酯类抗生素和4种代谢物。该方法使用罗红霉素作为内标以获得最大的准确度和精密度。研究结果表明，大多数大环内酯类抗生素及其代谢物相关系数良好（r2＞0.998），在浓度为 1 ng/mg～100 ng/mg均可检测到。所有分析物的回收率为62.27%～115.28%，LOD和LOQ分别为 0.30 μg/kg～0.85 μg/kg 和 1.1 μg/kg～4.0 μg/kg，日内和日间精密度分别低于10%和15%。Wen等[45]优化QuEChERS法中盐析溶剂萃取和净化管的净化步骤，结合LC-MS/MS分析多种可食用动物组织中磺胺类抗生素。在QuEChERS的清理步骤中，使用无滴落过滤板（Captiva ND-lipid），去除动物源性食品的蛋白和脂质。牛肉、猪肉和鸡肉样品的LOD为0.01 ng/g～0.03 ng/g，牛肚和猪肝样品的碘含量范围分别为0.02 ng/g～0.04ng/g，日内和日间精密度范围分别为1.0%～10.5%和0.4%～8.0%，准确度分别为95.2%～107.2%和97.8%～102.1%。采用响应面分析优化，进一步提升了QuEChERS方法的准确度和灵敏性；新组件（Captiva ND-lipid）的采用，解决了动物源食品中脂质和蛋白去除难的问题，Captiva ND-lipid可去除样品中99%以上的脂类和蛋白，确保痕量分析的精确度和重复性，特别适用于对样品洁净程度以及回收率要求高的样品分析。

3 基于相分配原理

3.1 液液萃取

LLE是基于分析物在两种不相容的液体或相（通常是水溶剂和有机溶剂）之间分配比或溶解度不同来进行分离、提取或纯化的预处理方法，也是最常用的萃取技术之一[46]。与传统的SPE相比，LLE可以通过多种形式的装置实现连续操作，处理大批量样品，具有分离效果好、成本低等优点。但LLE不易实现自动化操作，需要大量昂贵且有毒的有机溶剂，繁琐、耗时且对环境不友好。

Jank等[47]采用LLE结合液相色谱-电喷雾-串联质谱（liquid chromatogram-electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）建立了一种高通量、快速检测牛、猪、鸡肉和牛奶中大环内酯类抗生素（红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、替米考星和螺旋霉素）和林可酰胺类抗生素（林可霉素和克林霉素）的多残留分析方法。样品前处理过程中无任何提纯、净化等步骤，仅采用少量乙腈对样品提取，并详细优化提取参数，最大限度地减少基质效应和共存物的干扰。进而使用C18柱和由酸化乙腈和水组成的流动相实现色谱分离。结果表明，以变异系数表示的再现性值均低于19.1%，回收率和LOD分别为60%～107%和5 μg/kg～25 μg/kg。该方法避免了动物源食品中抗生素残留分析过程的固相萃取过程，具有分析时间短、成本低、样品制备简单等优点。

3.2 液相微萃取（liquid-phase microetraction，LPME）

LPME是一种基于相平衡原理用于样品前处理的LLE微型化方法。在LPME中，受体相的液滴保持在微型注射器针头的尖端，然后直接浸入样品中或悬浮在其表面之上，样品中的溶剂可以置于疏水膜的孔中，或者通过膜界面与供体相分离。LPME克服了LLE方法的局限性，提高了样品净化能力，减少了有机溶剂的消耗并可以使用多种液体萃取剂，如有机溶剂、水溶液和离子液体等[48]。LPME技术主要包括分散液液微萃取（dispersion liquid-liquid microextraction，DLLME）和中空纤维液相微萃取（hollow fiber liquid-phase microextraction，HF-LPME）。

DLLME因其溶剂消耗少、提取速度快、高富集倍数等优点，可用于在不同样品基质中精确提取和定量痕量分析物[49]。然而，DLLE应用于复杂样品基质时，由于常规提取液极性的限制，DLLME导致选择性和萃取效率较差。Wang等[50]采用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[C4MIM][PF6]）建立了DLLME结合HPLC测定肉类中4种喹诺酮类抗生素的方法。在最优条件下，该方法获得了4种喹诺酮类抗生素（诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星）的不同富集因子（11倍～42倍）。结果表明，4种药物的LOD为0.5 ng/mL～1.1 ng/mL，鸡肉、猪肉和鱼肉中的加标回收率为60.4%～96.3%，变异系数小于11.5%。Arroyo-Manzanares等[51]将DLLME和QuEChERS结合，采用HPLC-荧光检测法对牛奶样品中9种磺胺类抗生素的极性进行测定。该方法的提取和回收率为90.8%～104.7%和83.6%～104.8%。LOD分别低于1.21μg/L和2.73 μg/L。新型离子液体提取液以及多种前处理方法的有机结合提高了DLLME的萃取效率。

HF-LPME是一种由管壁纤维孔内的有机溶剂形成的支撑液膜进行传质，再利用聚丙烯制成和微型注射器支撑的多孔中空纤维内腔进行微萃取的技术。由于受体相与样品溶液无直接接触，因此避免了溶剂的损失[52]。HF-LPME还具有突出的样品纯化功能，因此扩大了分析基质的范围，使其可用于复杂基质样品的直接分析[53]。Tajabadi等[54]采用HF-LPME结合HPLCDAD用于测定4种四环素类抗生素和5种喹诺酮类抗生素。将中空纤维切成8 cm的长度，用含有10%Alijat-336的1-辛醇溶液浸渍以填充外部的孔隙，然后将1 mol/L NaOH-NaCl水溶液注射到纤维腔内，采用HPLC对富含分析物的受体相进行检测。在最佳参数条件下，不同抗生素的LOD和LOQ分别为0.5 ng/g～20 ng/g和1.25 ng/g～40 ng/g，日内和日间重复性分别为3.4%～10.7%和5.0%～11.5%。该方法适用于多种动物源性食品样品如鱼、牛奶和蜂蜜，以及羊肉和鸡肉的肝脏和肌肉等中9种抗生素的提取和测定。

4 结论与展望

本文主要介绍动物源性食品抗生素的高通量、多残留检测方法的相关研究进展。尽管高效和高分辨大型仪器的普及，提高了动物源性食品抗生素多残留检测的灵敏度和准确性。动物源性食品样品具有种类繁多、基质复杂和时效性强等特性，因此如何提高样品的取样、提取和净化等步骤效率仍需进一步研究。特别是针对食品安全监管的需求，开发更为简单快速、灵敏、低成本、可实现自动化操作的样品前处理方法是提高动物源性食品中痕量抗生素残留分析检测效率的必要手段。在样品前处理过程中，新型吸附剂、新前处理方法以及不同类型前处理方法的结合，在近年来动物源性食品抗生素残留中超灵敏检测研究中体现尤为突出。新型固相吸附剂的开发，如混合型强阳离子交换反相吸附剂、高选择性MIP吸附剂、纳米复合磁性吸附剂和新型高氟硼吸附剂等，解决了传统吸附剂存在的特异性弱、洗脱不彻底等问题，具备了选择性强、高亲和力等优点，同时展现了更好的回收率，提高了动物源性食品中抗生素的分析效率；同时，新型前处理方法的开发以及前处理方法的有机结合，如QuEChERS/96孔SPE平板法、液液微萃取与QuECh-ERS法的有机结合等，解决了处理样品单一和处理步骤繁琐等问题，具有廉价、高效、省时、便捷等优点。动物源性食品中抗生素多残留的检测仍存在以下问题有待解决：1）新型吸附剂对目标物的分离和富集机制不清晰，大部分仍停留在应用效果的研究上，对于机制研究不够深入；2）动物源性食品基质效应研究不够详细，除了通过基质校正曲线和标准加入方法以外，评价基质效应的新方法亟待研究；3）尽管无滴落过滤板（Captiva ND-lipid）等新前处理组件的出现，促进了动物源性食品基质中蛋白和脂类的处理效率，但标准化和自动化设备和组件的开发仍需进一步加强。