DNA甲基化水平检测在胃癌早期诊断中的研究进展*

陈锐泽 综述，张 勇 审校

1.厦门医学院临床医学系，福建厦门 361023；2.机能与临床转化福建省高校重点实验室，福建厦门 361023

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，目前其发病率在人体恶性肿瘤中排名第五，死亡率更是高居第三[1]。由于缺乏特异性的早期检测手段，绝大多数患者确诊时往往因病情恶化、延误治疗而丧失生命。绝大多数患者由于胃癌早期症状轻微而未重视，当身体出现明显不适时才就诊，此时多已发展至进展期胃癌，从而延误最佳治疗时机。据肿瘤数据统计显示，早期胃癌患者5年生存率可达91%，随着病情进展，肿瘤细胞侵袭至更深层组织时(如浆膜层、肌层)，患者5年生存率则降至26%[2]。当前，临床胃癌诊断仍主要依赖于侵入性内镜检查和病理活检[3]。利用侵入性内镜能直观地发现并评估病灶且相对无创，但成本及操作要求较高，同时也存在诸多禁忌证，且在孕妇、老年人等特殊群体中依从性不高且易发生并发症，因此无法作为胃癌早期筛查的有效手段。而病理活检虽然能够准确判断肿瘤大小及其分化程度，但无法较好评估患者整体病情发展状况，再者活检为有创检查，容易出现并发症，很难作为人群胃癌早期筛查的手段。这些检测手段的局限性给早期胃癌的诊断造成不少困扰。近年来，血清肿瘤标志物的检测广泛应用到临床，通过检测血清中相关肿瘤标志物如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)125、CA19-9，可对部分恶性肿瘤进行筛查[4]，但由于胃癌缺乏特异性标志物，所以该技术在早期胃癌诊断中仍存在局限性。

CHEN等[5]研究发现，多数消化道肿瘤患者血浆中的脱落循环肿瘤细胞DNA(ctDNA)具有特异的甲基化水平，能够及时且高效地对胃癌、结直肠癌等多种消化系统常见肿瘤进行早期诊断，从而极大提高癌症患者早期生存率。同时，PHALLEN等[6]检测结直肠癌患者的血浆发现，患者血浆中ctDNA水平明显高于健康个体，因此对血浆中ctDNA进行分析可能有利于识别肿瘤相关特异性改变[6]。随着对表观遗传学研究的不断深入，人们在胃癌细胞中也能检测到DNA异常甲基化，部分调控细胞基因启动子区异常高甲基化可导致细胞中的抑癌基因失活[7]，从而导致细胞异常生长，而这对早期胃癌的诊断和预后意义重大。通过检测体内特异性基因异常甲基化程度有望成为一种胃癌早期无创性的检测手段，从而较大程度提高胃癌患者早期检出率。本文拟就当前DNA甲基化水平检测在胃癌早期诊断中的研究进展进行综述，以期为寻找胃癌早期诊断分子标志物提供新思路。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化指甲基基团在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化作用下添加至胞嘧啶第5号碳的残基上的修饰过程[8]，该过程多发生于富含胞嘧啶和尿嘧啶的CpG岛(即具有高密度胞嘧啶-鸟嘌呤2种核苷酸的DNA区域)中。DNA甲基化是细胞生长发育过程重要的调控机制。有研究表明，DNA异常甲基化与多种恶性肿瘤的发生之间关系密切，尤其与细胞分裂相关的原癌基因、抑癌基因和DNA损伤修复基因[7]。DNA异常甲基化即抑癌基因启动子区的高甲基化及原癌基因广泛区域的低甲基化，其中高甲基化多发生于抑癌基因的5′端启动子区域的CpG岛上[9]，该区域上累积的高水平甲基胞嘧啶使抑癌基因失活，或致使调控细胞周期机制的相关蛋白如p27表达下调，从而导致细胞过度生长[10]；而低甲基化多发生于全基因组的原癌基因区域[11]，大量的原癌基因低甲基化导致原本应当沉默的基因被异常激活，从而增加DNA信息传递过程中的不稳定性，加速肿瘤的演进。通常DNA低甲基化与抑癌基因高甲基化往往是相伴发生的，只是发生区域有所不同。目前对人类Runt相关转录因子-3(RUNX3)基因、hMLH1基因、RASSF1A基因和SEPTIN9基因的高甲基化与胃癌的发生机制研究较多。

2 DNA高甲基化与胃癌发生的相关机制

DNA异常甲基化可能与肿瘤细胞的发生、转移和侵袭关系密切[12]。正常机体内的各种细胞新陈代谢受多种基因共同调控，其中与肿瘤细胞密切相关的包括原癌基因和抑癌基因。后者在细胞周期、DNA损伤修复、细胞分化等过程中均起到重要作用。体内DNA异常甲基化主要发生在富含CpG岛的启动子区域，该区域的异常高甲基化会阻碍转录因子与启动子结合，从而使抑癌基因无法转录或者转录水平降低。抑癌基因的沉默易导致胃癌细胞生长分裂不受控制，甚至使肿瘤细胞有更多机会脱离原位细胞基质侵袭扩散至外周，从而促进胃癌的进一步发展[12]。

3 胃癌中几种常见异常甲基化的基因

3.1RUNX3基因 RUNX3基因主要位于人染色体1p36.11，其表达的RUNX3蛋白是转化生长因子-β(TGF-β)信号转导通路中Runt转录因子的重要组成部分[13]，同时RUNX3蛋白也是重要的肿瘤抑制因子[14]，其在细胞分化、细胞周期调控、细胞凋亡和恶性转移过程中意义重大。有研究表明，RUNX3蛋白能够调节胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡过程[15]，抑制正常胃组织细胞过度生长。而RUNX3基因启动子区域高甲基化会导致该蛋白表达下降，同时降低TGF-β信号转导通路敏感性。LU等[16]对胃癌患者血清中游离RUNX3基因启动子区DNA甲基化程度检测发现，该基因在胃癌细胞血清中的甲基化水平高达75.2%。HU等[17]对比正常胃上皮组织与胃肿瘤组织发现，RUNX3基因启动子区域甲基化程度与胃肿瘤细胞侵袭深度呈正相关。因此，RUNX3基因有望成为胃癌早期诊断的重要标志物[18]。

3.2hMLH1基因 hMLH1基因位于人染色体3q21-23，是人类DNA修复基因中的重要成员[19]，它能够编码DNA错配修复酶，从而调控细胞内源性修复功能，维持基因组的稳定性。同时，当机体DNA大量损伤时，hMLH1基因编码的修复酶能够进一步被激活，修复错配的碱基对，防止DNA损伤的累积，从而抑制癌细胞的发展。有研究表明，hMLH1基因启动子区异常高甲基化是正常胃黏膜细胞发生微卫星不稳定性(MSI)现象，甚至发展为胃癌的重要因素[20]。因此，检测标本中hMLH1基因甲基化程度对胃癌早期诊断有重要意义。WANI等[21]研究发现，hMLH1基因在胃癌中的甲基化率为72.9%，同时YE 等[22]对2 182例胃癌病例及对照组进行Meta分析发现，胃癌组织或血清中hMLH1基因启动子异常甲基化与胃癌发生呈正相关，且在肿瘤中晚期(发展至淋巴结转移)表达明显下调，表明hMLH1基因启动子甲基化常发生在胃癌的发展阶段，且随着胃癌由癌前病变到肿瘤的发展过程中甲基化程度不断升高。因此，hMLH1基因甲基化程度或可作为胃癌诊断的指标之一。

3.3RASSF1A基因 RASSF1A基因属于ras家族的重要组成部分，其主要通过抑制细胞周期蛋白D1从而引起细胞周期阻滞，限制细胞无限制地分裂生长[23]。以胃癌为主的原发性肿瘤细胞中常能够捕捉到RASSF1A基因的高甲基化[24]，而在肠化生、胃腺瘤等其他胃疾病中均未发现其异常甲基化的发生。对比不同肿瘤TNM分期患者胃癌细胞RASSF1A甲基化程度发现，Ⅲ和Ⅳ期胃癌患者胃癌细胞甲基化频率明显高于Ⅰ和Ⅱ期胃癌患者胃癌细胞[25]，因此RASSF1A基因甲基化程度可能与胃癌分期联系密切，可作为胃癌诊断及治疗效果的监测指标之一。

3.4SEPTIN9基因 SEPTIN基因可分为13种亚型，其中位于17q25.3的SEPTIN9基因与多种原发性肿瘤的发生密切相关。肿瘤细胞SEPTIN9基因5′端的CpG岛多可检测出异常高甲基化[26]。由SEPTIN9基因表达的SEPTIN9蛋白能调控细胞生长，防止其生长过快或不受控制性生长。而当SEPTIN9基因启动子区因高水平甲基化而沉默时，基因表达停止，正常细胞便不断向肿瘤细胞方向发展。SEPTIN9基因高甲基化的检测已应用于结直肠癌的早期筛查、诊断、病理分期乃至术后预后判断中[27]。有研究发现，胃癌的发生与SEPTIN9基因联系密切，这可能与SEPTIN9蛋白参与胃癌发展中的MSI现象密切相关[26]。随着对该基因与胃癌关系更深入的研究，SEPTIN9基因有望成为胃癌早期诊断的指标之一。

4 DNA甲基化水平检测技术的进展

4.1甲基化特异性聚合酶链反应(MSP) MSP是传统的DNA甲基化水平检测技术，其针对特定甲基化位点两端设计引物，以亚硫酸盐化的待测样品为模板(亚硫酸化可将未甲基化的胞嘧啶可转化为尿嘧啶)，利用实时定量PCR技术，实现待测标本甲基化水平的定量分析。由于DNA异常甲基化在肿瘤细胞中常有发生[28]，因此MSP在肿瘤监测中简便快捷，灵敏度较高。但由于定量PCR技术依赖于标准曲线进行绝对定量，因此要求所测基因需要有标准品。这给甲基化水平检测造成了一定的局限性。

4.2数字PCR(dPCR) dPCR技术能够将标本均匀分隔后随机分配至不同腔室内进行检测，依据泊松分布的原理实现检测结果绝对定量[29]。dPCR能够不依赖标准品实现甲基化水平检测结果的绝对定量。同时，dPCR能够极大地提高DNA甲基化水平检测的特异度和灵敏度。但是，dPCR局限于测定DNA上单一位点的甲基化水平，不能实现高通量的多位点甲基化水平测定。

4.3二代测序(NGS) NGS主要依据DNA测序技术能够检测标本中的DNA片段的序列及其含量，具有极高的检测通量及灵敏度。对标本进行亚硫酸盐处理后能够实现特定基因的甲基化水平检测。该技术能有效克服待测标本DNA含量少、检测位点单一等问题，实现甲基化水平检测微量化、高通量化，压缩了检测时间。此外，随着基于分子条形码(UMI)超深度NGS(即针对不同标本加入特异性碱基序列，从而分辨识别假阳性标本)的发展，NGS检验的灵敏度和特异度也在不断提高[30]。然而，该方法成本高昂，不适宜大规模推广[31]。

5 小结与展望

随着对表观遗传学的深入探讨，越来越多的研究支持人体内DNA异常甲基化与胃癌的发生关系密切。然而，异常甲基化导致胃癌的机制尚未完全阐明，仍需要大量的随机对照研究来佐证。此外，DNA异常甲基化与不同肿瘤发生之间也存在非特异性和不统一性。因此，胃癌的早期诊断仍需更高特异度的DNA异常甲基化水平模型支持辅助诊断。加强对胃癌DNA异常甲基化位点的研究，更深入研究特异性分子标志物在胃癌发生中的机制意义重大。此外，DNA甲基化水平检测缺少同时具备高特异度和灵敏度的分析方法，MSP、dPCR及NGS法检测基因甲基化水平各有短板，深入探索更多特定甲基化位点，定制胃癌特异性DNA甲基化水平检测基因芯片或有望克服现阶段的弊端。同时，DNA异常甲基化水平的检测不仅对胃癌早期诊断有帮助，在相关肿瘤的治疗、预后判断中也发挥重要作用[26]。目前，SEPTIN9基因异常甲基化水平已运用于判断结直肠癌治疗的预后[27]。因此，进一步阐明DNA异常甲基化在胃癌中的机制，探索特异性的分子标志物不仅能提高胃癌的早期诊断率，还能够辅助判断癌症进展，为临床治疗提供更多帮助。