植物基核桃酸奶的研制

汤木果，汪科成，赵存朝,2，陶亮,2，田洋,2,3

（1.云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201；2.国家辣木加工技术研发专业中心，昆明 650201；3.云南省生物大数据重点实验室，昆明 650201）

0 引言

核桃（Juglaus Regia L.）又名胡桃、羌桃、万岁子，系胡桃科核桃属植物，是世界四大干果之一[1]。核桃具有较高的营养价值，含有20%～25%的优质蛋白[2]，8种必需氨基酸含量合理[3]，人体消化率可达87%[4]，并且还含有一些人体必需的多种维生素、微量元素和矿物质[5]。核桃中不饱脂肪酸含量较高，尤其是油酸、亚油酸及亚麻酸含量较高[6]，若长期食用，不仅不会升高血糖，还能在一定程度下减少人体对胆固醇的吸收，三高人群也可放心食用[7]。云南作为我国核桃生产的第一大省，目前核桃种植面积为4230万亩，产量为102万t，产值已达305亿元[8]，种植面积、产量和产值均居全国之首。近年来，核桃产量持续增长，但产品较单一，主要以干果为主，精深加工不足，市场消耗量低，严重制约核桃产业健康发展。

传统酸奶都是以动物源（牛乳）为原料[9]，而植物基酸奶是以纯植物基成分为原料，添加菌种，采用生物发酵工艺以“植物蛋白”替换“动物蛋白”为原料制作的发酵乳[10]。核桃具有丰富的营养成分和保健作用，并含有优质的蛋白质和不饱和脂肪酸，必需氨基酸含量合理且易消化，以植物基核桃为原料开发酸奶，不仅可以丰富核桃制品的产品种类，同时可满足当代人对于健康与营养新产品的需求。相较于传统酸奶，植物基核桃酸奶具有高蛋白、低脂肪、无乳糖、不含胆固醇、更易消化、吸收和提高各种营养素的利用率，且适合各个年龄阶段的人饮用。目前，国内外已有利用植物蛋白进行部分或完全替代乳蛋白制备酸奶的研究，但以核桃作为植物基酸奶原料的研究较少。本研究以核桃仁为主要原料研发一款质地良好、口感最佳、味道醇香且营养丰富、健康的植物基酸奶，这不仅可以丰富核桃产品品类，也可为云南核桃产业化生产和精深加工奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱皮核桃仁，大理百里园生态食品发展有限公司；低聚果糖粉，郑州化工原料有限公司；增稠剂（HBT-A3168、HBT-A1402、HBT-A5370），江苏豪蓓特食品化学有限公司；植物淡奶油，青岛雀巢食品有限公司；鼠李糖乳杆菌，实验室自冻干直投式菌种；乳酸菌k T-A8、土耳其菌种、乳酸菌CHN-22、乳酸菌1821DSL，北京正洺嘉科科贸有限公司；Mild 1.0菌种、YF-L904菌种、R-707菌种，科汉森菌种生物科技公司。

1.2 仪器与设备

胶体磨，常州华奥仪器制造有限公司；HJJ-6水浴恒温电动搅拌器，常州华奥仪器制造有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶机，北京世纪阳光有限公司；高压均质机SRH，上海申鹿均质机有限公司；数显恒温水浴锅，常州华奥仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺设计

（1）工艺流程。

去皮核桃仁→清洗及浸泡→打浆→过滤去渣→磨浆→核桃乳→配料→预热→均质→杀菌→接种发酵→植物基核桃酸奶

（2）操作要点。

①清洗及浸泡：将核桃仁置于25℃蒸馏水中，按料液比1∶3（w/v）在浸泡16 h，备用。

②预热：在50～60℃下加热10 min，过60目筛进行均质。

③均质：采用二次均质对核桃乳进行均质，先在20 MPa均质压力下均质5 min；再在40 MPa的更高压强下均质10 min。

④杀菌：在75～85℃条件下杀菌15 min，既要保证充分杀菌，又不能对核桃蛋白造成过度变性，以免影响植物基酸奶的质地及风味。

⑤接种发酵：接种1.2%菌种发酵液，在31.5℃下发酵16 h，进一步促进植物基酸奶的形成及产酸产香。

⑥后熟：植物基核桃酸奶发酵结束后，在4℃条件下冷藏后熟24 h，进一步后熟产酸产香，完善酸奶的风味和滋味。

1.3.2 菌种活化

使用直投式乳酸菌混合菌种。接种在MRS肉汤中，37℃培养24 h，激活乳酸菌。制备核桃乳培养基（打浆后的核桃乳，按5∶1与牛奶复配），连续3次进行活化；将1 mL解冻的储备培养物接种100 mL无菌核桃乳培养基中，并在37℃下培养，直到p H达到4.5时制备发酵剂[11-12]。

1.3.3 菌种筛选

以感官评分及p H为指标，对直投式乳酸菌种进行筛选。

1.3.4 单因素试验及响应面优化试验

以植物基核桃酸奶p H 4.5时的发酵时间TpH4.5（h）、感官评分、持水性为分析指标，考察低聚果糖添加量（%）、发酵温度（℃）、科汉森菌种YF-L904发酵剂接种量（%）对植物基核桃酸奶的影响，确定响应面优化最佳工艺因素水平。利用响应面二次中心组合试验，以低聚果糖添加量X1（%）、发酵温度X2（h）、发酵剂接种量X3（%）为自变量，以TpH4.5、感官评分、持水性为响应值，通过响应面二次中心组合试验优化植物基核桃酸奶最佳工艺配方。响应面二次中心组合优化试验因素与水平如表1所示。

表1 响应面二次中心组合优化试验的因素及水平

1.3.5 产品质量

1.3.5.1 感官评定

选择10名专业人士组成评定小组（5名男性，5名女性）对植物基核桃酸奶的感官特性进行评估。在色泽和外观（5分）、滋味（5分）、气味（5分）、组织状态（5分）4个方面进行感官评定。其感官评分标准如表2所示。

表2 植物基核桃酸奶的感官评分标准

1.3.5.2 产品质量指标测定

（1）持水性测定。

参考熊政委[13]等方法并稍作修改。取10 m L核桃酸奶放入离心管。使用电子天平称量离心管质量记W1，加入植物基核桃酸奶后的总质量记为W2，4 000 r/min，离心10 min，静置10 min，去除上清液后，剩余质量记为W3。持水性计算公式：

式中：W1为离心管质量；W2为植物基核桃酸奶总质量；W3为去除上清液后，剩余质量。

（2）发酵过程中植物基酸奶p H测定。

根据p H计使用说明，对p H计进行校准，用玻璃电极对发酵过程中的植物基核桃酸奶每10 min测量一次p H值。

（3）黏度的测定。

使用校正后的旋转式黏度计进行测定3次，最终结果取平均值[14]。

（4）硬度的测定。

使用校正后的硬度计直接测定3次，最终结果取平均值。

（5）其他指标。

蛋白质含量：参照《GB 5009.5-2016凯氏定氮法》的方法测定；脂肪含量：参考《GB 5009.6-2016索氏抽提法》的方法测定；水分含量：参照《GB 5009.3-2016直接干燥法》的方法；碳水化合物含量：参照《GB 28050-2011食品安全国家标准预包装食品营养标签通则》的方法测定；粗纤维含量：参照《GB/T 5009.10-2003植物类食品中粗纤维的测定》的方法测定；乳酸菌数测定：参照《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[15]；大肠杆菌检测：参考《GB4789.3-2016食品微生物学检验大肠菌群计数》[16]。

1.3.6 数据统计与分析

数据处理及统计分析采用Excel 2013对实验数据进行整理，利用设计专家Design-Expert8.0.6进行响应面分析、利用SPSS24对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

植物基核桃酸奶所采用的乳酸菌种发酵剂能代谢植物蛋白制品中难以被人体快速吸收的寡糖类生成乳酸，从而提高植物蛋白的生物利用率，减少胃肠涨气、同时促进肠道蠕动，有助于消化和肠道健康；同时乳酸菌能赋予植物饮料“生物活性”的价值：合成维生素B族，水解蛋白质和碳水化合物[17]，有宜于人体快速吸收营养；使植物基核桃酸奶在不含动物成分，同时保留了酸奶和益生菌乳饮料所有的优势。

根据试验发现不同菌种对植物基核桃酸奶的感官品质和p H值有影响。筛选不同菌种对植物基核桃酸奶的感官品质和pH值如图1所示，发现p H值最高的菌株是1821DSL，同时感官评分最低，植物基核桃酸奶质地不均匀，色泽较灰暗，口感及风味较差。其次是鼠李糖乳杆菌。然而感官评分最高的菌株是YF-L904，p H值大概在5.8左右，植物基核桃酸奶组织细腻，色泽均匀，口感及风味较好。发酵剂R-707和土耳其菌种发酵所得酸奶pH最低，但其对应的酸奶口感和风味不及YF-L904发酵所得。最终根据酸奶发酵的组织状态、口感、风味、感官评分和p H综合分析筛选后，最终选定感官评分最高、口感及风味较好、p H值适宜的直投式YF-L904为植物基核桃酸奶最佳发酵菌株。

图1 植物基核桃酸奶发酵菌株筛选结果

2.2 单因素试验结果

根据植物基核桃酸奶加工工艺流程及操作要点，筛选低聚果糖添加量（2.9%、4.9%、6.9%、8.9%、10.9%）、菌种接种量（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）、发酵温度（25、30、35、40、45、50℃）对植物基核桃酸奶p H 4.5时的发酵时间、感官评分、持水性的影响，结果如图2所示。

低聚果糖是一种可溶性膳食纤维，人体摄入后，由于不被消化吸收，因而能到达大肠被肠道内有益菌群选择性利用，促进双歧杆菌等有益菌的增殖，有效调节肠道菌群[18]。同时，低聚果糖在酸性条件下的稳定性优于蔗糖，且较蔗糖甜味清爽，味道纯净，不带任何后味，甜度不会发生变化，对植物基核桃酸奶的口味没有影响。低聚果糖的热量很小，不会导致肥胖，并且具有良好的生理功能[19]，还能解决人们乳糖耐受性问题，增加水溶性可吸收钙的含量，使乳制品更易消化吸收。由图2（a）可知，在菌种接种量3.5%，发酵温度40℃条件下，考察低聚果糖添加量对植物基核桃酸奶的影响。添加低聚果糖后，植物基核桃酸奶除了感官评分之外，TpH4.5和持水性随着低聚果糖添加量增加而增加，当低聚果糖添加量在6.9%时，感官评分最高，TpH4.5和持水性出现缓慢增加，最终趋于平缓的趋势。随着乳低聚果糖添加量的增加，植物基酸奶口感逐渐变差，主要原因是由于低聚果糖添加量过多可能会增加甜味，导致植物基核桃酸奶过甜。因此，确定低聚果糖添加量为6.9%为宜。

由图2（b）可知，在低聚果糖添加量6.9%，发酵温度40℃条件下，植物基酸奶的感官评分、TpH4.5和持水性随着菌种接种量的增加呈现先上升后下降趋势。当菌种接种量在3.5%时，植物基酸奶的感官评分、TpH4.5和持水性最高，随后感官评分、TpH4.5和持水性降低，这说明菌种接种量的添加对植物基酸奶形成有较大影响，菌种接种量添加过少，酸奶发酵不成功，产生明显沉淀，呈现比较稀的状态即组织状态差、伴有有乳清析出等，菌种接种量添加过多造成酸奶酸度过高，最终感官评分、TpH4.5和持水性低，本实验与杨露西[20]的实验结果相似。因此，低聚果糖添加量为6.9%最佳。

发酵温度可以影响植物基核桃酸奶的持水性，同时可能对植物基核桃酸奶的TpH4.5和感官评分具有一定影响。由图2（c）可知，在低聚果糖添加量6.9%、菌种接种量3.5%条件下，随着发酵温度的升高，植物基酸奶的感官评分、TpH4.5和持水性均呈先上升后下降趋势，当发酵温度达到40℃时，其感官评分、TpH4.5和持水性均达到最大值。而发酵温度过低时出现凝乳不够完全、产酸产香不足的问题，当发酵温度为过高时，出现乳清析出、组织状态变差的现象。因此，最佳植物基核桃酸奶发酵温度为40℃。

2.3 响应面试验优化结果

2.3.1 响应面试验设计及结果分析

在单因素试验基础上，以低聚果糖添加量X1（%）、发酵温度X2（℃）、发酵剂接种量X3（%）为自变量，以TpH4.5、感官评分、持水性为响应值，利用响应面进行3因素5水平二次中心组合试验设计，试验方案及结果见表3，回归分析见表4。

表3 响应面二次中心组合试验方案及结果

2.3.2 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对表5进行多元回归拟合，得到核桃酸奶发酵时间（Y1）、感官评分值（Y2）、持水性（Y3）与低聚果糖添加量（X1）、菌种接种量（X2）、发酵温度（X3）的二次方程模型为：

Y1=18.46-1.41X1-0.34X2-0.73X3+0.38X1X2+0.30X1X3-0.62X2X3-0.15X12-0.42 X22-0.33X32

Y2=10.89-0.27X1-1.81X2-1.20X3+1.75X1X2-1.50 X1X3+1.50X2X3+1.64X12+0.76X22+1.64X32

Y3=0.83-0.030X1-0.14X2-0.079X3+0.11X1X2-0.096 X1X3+0.12X2X3+0.091X12+0.024 X22+0.093X32

回归模型的方差分析结果见表4。

表4 回归模型方差分析表

采用方差分析对TpH4.5、感官评分、持水度进行回归模型、个体模型系数进行显著性检验。由表4、表5可知：植物基核桃酸奶TpH4.5、感官评分、持水性回归模型显著性检验P值均＜0.01，说明3个响应指标二次多元回归模型极显著；植物基核桃酸奶TpH4.5、感官评分、持水性失拟性检验P值均＞0.05，可以认为3个响应指标二次回归模型与实际试验拟合性模型失拟不显著。说明模型可以接受，即表明所选植物基核桃酸奶TpH4.5、感官评分、持水性二次回归模型可用于预测设定的参数，即可用于评估植物基核桃酸奶的TpH4.5、感官评分、持水性变化。综上所述，回归模型拟合程度良好，能够准确的分析和预测植物基核桃酸奶植物基核桃酸奶TpH4.5、感官评分、持水性，说明实验操作可信度高，具有一定实际应用价值。

表5 响应与过程变量之间关系的二阶多项式方程的回归系数

2.3.3 最佳条件的确定和回归模型的验证

通过响应面法优化核桃酸奶制作的最佳工艺条件如表6所示。

表6 最佳工艺参数预测和实验结果

结果表明，植物基核桃酸奶的生产是由多种因素共同影响。响应面优化最佳条件为：低聚果糖添加量为9.3%，接种量为1.2%，发酵温度为31.5℃，在此条件下，植物基核桃酸奶p H降至4.5时的发酵时间为16 h，感官评分18.93分，持水性1.33%。响应面优化出的此配方工艺可信度为91.7%。通过RSM优化核桃酸奶的最佳工艺配方，并进行了试验验证，3次试验的平均值与预测值吻合较好，均在可接受的范围内。

2.4 植物基核桃酸奶的产品质量指标测定

植物基核桃酸奶的产品质量指标如表7所示。

表7 植物基核桃酸奶的理化特性

由表7可知，制备的植物基核桃酸奶硬度为423.1 g，黏度为9 304 mPa·s，持水性为1.33%，说明该产品质构特性达到最优，蛋白质含量达到5.28%，与市面上的酸奶相比，高于大部分酸奶蛋白质含量，是一种高蛋白的酸奶，脂肪含量达到22.67%，由于核桃中具有较高的不饱脂肪酸，特别是油酸、亚油酸及亚麻酸，容易被人体消化吸收，不易在体内形成脂肪堆积导致身体发胖[21]，水分含量为52.04%，植物基核桃酸奶呈现出组织细腻、质地均匀的状态，粗纤维含量为0.47%，乳酸菌数为1.65×109CFU/g和大肠菌群未检出，符合国家标准。与动物酸奶相比，植物基核桃酸奶不仅蛋白质含量可以达到动物酸奶标准，同时具有不含胆固醇、低脂肪、易消化等优点，且植物基核桃酸奶不含乳糖，对乳糖不耐症人群十分友好。

3 结论

纯植物基核桃酸奶加工的最佳发酵剂菌种为直投式YF-L904菌种，其低聚果糖添加量为9.3%，接种量为1.2%，发酵温度为31.5℃。此条件下，发酵16 h后植物基核桃酸奶pH降至4.5时的植物基核桃酸奶色泽呈乳白色，香气浓郁，滋味厚重，凝固性好，其硬度为423.1 g、黏度9 304 mPa·s、持水性1.33%，整体感官品质较佳；蛋白质含量5.28%，脂肪含量22.67%，水分含量52.04%，粗纤维0.47%，乳酸菌数为1.65×109CFU/g、大肠杆菌未检出，开发的植物基核桃酸奶是一款高蛋白、低脂肪的纯植物基酸奶，具有一定的新颖性，营养价值高，具有一定的市场前景，同时核桃酸奶产品的开发对核桃产业发展也具有一定的推动意义。