微孔板式微生物法检测乳粉中叶酸的质量分数

王晶，林泽栋，李艳，薛晓晶

（1.中检科（北京）测试技术有限公司，北京 100123；2.中国检验检疫科学研究院综合检测中心，北京 100123）

0 引言

叶酸是人体营养代谢重要的辅助因子及前体物质[1-2]，需通过饮食摄取[3]。叶酸缺乏可导致生理功能低下及某些疾病，尤其是孕妇存在新生儿神经管畸形、早产等风险[4-5]。婴幼儿适量补充叶酸，对其神经与脑细胞发育有良好的促进作用[6]。

叶酸测定方法有微生物法、酶联免疫法、液相色谱法、免疫亲和层析法等[7-10]。微生物法是测定叶酸的主要方法和仲裁方法[11]。但微生物方法操作复杂，不适合高通量检测[12]。为简化操作，近年出现了相关试剂盒的研究[13-14]，但试剂盒方法也存在成本高，培养时间长等问题。杨小平[15]等人参考商品化试剂盒研究了EP管法测定叶酸含量，培养时间也需要40 h以上。因此，有必要建立一个高效准确，操作简便的检测方法。

本文选择微孔板培养，用酶标仪替代分光光度计测定叶酸结果。其准确度高、可操作性强、重复性好，且较之其他方法用时短，与国标方法检测结果一致，适合高通量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳粉样品，市售；叶酸质控样品，婴儿配方乳粉（QC-IP-703），中国检科院测试评价中心。菌种：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）（ATCC 7469）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

试剂：叶酸标准品，（纯度99.8%），上海安谱实验科技股份有限公司；乳酸杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌肉汤培养基、叶酸测定用培养基，北京陆桥生物技术有限公司。

XS105电子天平、S220p H计，梅特勒-托利多公司；KQ-25Z超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；G180TW高压灭菌锅，中国致微公司；MIR-254-PC培养箱，日本Panasonic公司；multiskan go酶标仪，美国Thermo公司；NU-437-600E生物安全柜，梅特勒-托利多公司；高结合培养板、TC处理培养板，美国Corning公司；BIOFIL TC处理培养板，广州洁特生物过滤股份有限公司；耐思普通培养板、耐思TC处理培养板，无锡耐思生命科技股份有限公司；Cycler Seal Sealing Film，美国Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

叶酸标准储备液（20.0μg/mL）：精确称取叶酸标准品20.0 mg，用氢氧化钠乙醇溶液溶解，定容至1 000 mL。

叶酸标准中间液（0.200μg/mL）：吸取1 m L叶酸标准储备液，用氢氧化钠乙醇溶液稀释，定容至100 m L。

叶酸标准工作液（0.100 ng/mL，0.200 ng/mL）：吸取50μL叶酸标准中间液，用蒸馏水稀释，定容至100 m L，得到0.10 ng/m L高浓度标准品工作液；吸取100μL叶酸标准中间液，用蒸馏水稀释，定容至100 mL，得到0.20 ng/mL低浓度标准品工作液。

1.2.2 样品前处理

按照国标GB 5009.211-2014[18]的直接提取法对样品进行前处理。根据样品中叶酸含量用水对样品提取液进行适当稀释，使稀释后样品提取液中叶酸质量浓度在0.2～0.6 ng/mL范围内。

1.2.3 标准品和样品提取液的无菌处理

将配好的叶酸标准工作液、稀释后的样品提取液，于121℃高压灭菌5 min，冷却后备用。

1.2.4 制备接种液

将培养好的鼠李糖乳杆菌种子液振荡混匀，吸取50μL菌悬液，无菌条件下接种到5 mL叶酸测定用培养基中，37℃培养6 h。振荡混匀，制成接种液备用。

1.2.5 微孔板选择

选取Costar 3590高结合培养板、Costar 3599 TC处理培养板、BIOFIL TC处理培养板、耐思普通培养板和耐思TC处理培养板。比较标准曲线各点A550的吸光度值和叶酸质控样品（QC-IP-703）的结果。

1.2.6 微孔板操作

将灭菌后的叶酸标准品工作液、样品提取液按照表1和表2加入到96孔微孔板中，每个浓度做3个平行。每个微孔再加入150μL含有0.3%菌悬液的叶酸测定用培养基。空白孔加入无菌悬液的培养基。

表1 叶酸标准品工作液的配制

表2 样品提取液的配制

1.2.7 培养及测定

将微孔板用无菌封口膜覆盖后置于37℃恒温培养箱中培养22 h。培养后将微孔板充分混匀，用酶标仪于550 nm测吸光度（OD）。

1.2.8 准确性实验和重复性实验

在无叶酸的乳粉中加入终质量分数分别为30，60，120μg/100g和240μg/100g的叶酸标准溶液，每个加标浓度做5个平行计算回收率结果。

随机选取6个不同品牌的配方乳粉，每种乳粉进行6次重复性实验，计算相对标准偏差。

1.2.9 方法比对实验

选取不同段、不同配方乳粉，分别用国标方法和微孔板法测定其叶酸含量，并对结果进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 微孔板比对结果

相同实验条件下使用不同品牌型号的培养板，叶酸标准曲线各点A550的吸光度和叶酸质控样品的结果如表3和表4所示。结果显示，5种不同的培养板对不同浓度的叶酸标准溶液测得的吸光度值基本一致，叶酸质控样的检测结果值均符合质控值范围。

表3 不同培养板标曲吸光度值比较

表4 不同培养板叶酸质控样结果比较μg/100g

2.2 标准曲线

以叶酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，四参数方程拟合标准曲线，结果见图1。叶酸浓度在0.00～0.20 ng/m L，标准曲线的线性关系良好，R2=0.9997。

图1 叶酸标准曲线

2.3 加标回收实验

在无叶酸的乳粉中加入终质量分数分别为30，60，120μg/100 g和240μg/100 g的叶酸标准溶液进行加标回收实验，每个加标浓度做5个平行计算回收率，结果如表5所示。结果表明4个加标质量分数，回收率范围为96.5%～104%，平均回收率为101%±4.18%。

表5 加标回收实验结果μg/100g

2.4 重复性实验

选取6种不同叶酸含量的配方乳粉，用微孔板法测定叶酸含量，每个样品做6个平行，结果见表6。检测结果的RSD在1.60%～4.27%之间。

表6 重复性实验结果μg/100g

2.5 方法比对结果

选择婴儿配方乳粉、较大婴儿及幼儿配方乳粉、乳蛋白深度水解配方粉、特殊医学用途配方全营养粉和孕妇乳粉，标记为样品1-样品6，分别用国标法和微孔板法测定叶酸含量，每种样品6个平行，结果见表7。对2种检测方法的结果进行配对t检验，t=2.570，P=0.126，P＞0.05，2种方法无显著差异。

表7 比对实验结果μg/100g

（续表7）

3 结论

在国标基础上，用96孔微孔板代替玻璃试管进行微生物培养，既简化操作又可防止玻璃试管上残留的油脂和洗涤剂等外来因素对菌种的影响。96孔微孔板大多为聚苯乙烯材质，实验结果表明聚苯乙烯对本实验的适应性强，进口和国产不同规格的培养板差别不大。因本实验不需要用到板盖，考虑成本可以选择不附带板盖的微孔板。此外，在微孔板中直接对样品提取液和标准工作液进行梯度稀释，无需先在离心管中稀释、混匀再分装到各孔，减少了操纵步骤，提高了结果稳定性。按本方法的接菌方式和接菌量，22 h即可测定结果，缩短了样品的培养时间。微孔板法重复性和准确度较好，与国标方法相比检测结果无显著性差异；与商品化试剂盒相比，成本更低。本方法适合大批量样品检测，适合在乳粉企业和检测机构推行。