利用SSR标记分析白萝卜自交系的遗传多样性

王庆彪 王艳萍 张丽

（北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，蔬菜种质改良北京市重点实验室，北京 100097）

萝卜（Raphanus sativusL.）是起源于我国的重要十字花科蔬菜作物，栽培历史悠久，类型多种多样，其中白萝卜是我国长江以南地区主要栽培类型（汪隆植和何启伟，2005）。20 世纪90 年代韩国优良白萝卜品种引入我国，并在短时间内大面积推广，其中耐抽薹春白萝卜在我国云南、贵州、四川、湖北和湖南等高山地区广泛种植，不仅满足了夏季鲜菜市场供应，还对山区农民致富发挥了重要作用（包崇来 等，2019）。目前，市场上主推的该类型品种仍然以进口为主，因此选育具有我国自主知识产权的品种是当前萝卜育种急需解决的问题。

在品种选育过程中，亲本遗传基础狭窄是导致育种进展缓慢的原因之一，亲本材料的遗传多样性对于了解现有种质的遗传背景和亲本选配具有十分重要的意义。随着生物技术的发展，分子标记技术在育种中已被广泛应用，其中SSR（simple sequence repeat）标记具有多态性高、稳定性好、共显性、操作简单、易于鉴别基因型等优点，在萝卜连锁图谱与基因定位（Nakatsuji et al.，2011；Shirasawa et al.，2011；Wang et al.，2018）、指纹图谱构建（王庆彪 等，2015；郑思宇 等，2021）和遗传多样性分析（Wang et al.，2007；Shen et al.，2013；Zhai et al.，2014；杨峰 等，2019）中发挥重要作用。Wang 等（2015）从626 对EST-SSR 中标记筛选出50 对引物研究了萝卜属3 个野生种和6 个栽培亚种83 份材料的遗传多样性，遗传相似系数变幅为0.58～0.99，依据不同亚种、生态类型和植物学性状可将全部材料分为4 个Group，其中GroupⅠ为栽培种，进一步可分为7 个亚组。Lee和Park（2017）、Bae 等（2015）分别利用60 对和27 对SSR 标记分析了126 份和136 份萝卜栽培品种的遗传多样性以及SSR 标记与主要农艺性状的关联，均揭示了不同地理来源和生态类型间萝卜的遗传变异，及在商业化育种中的作用。充分了解已有育种材料的遗传变异程度是合理利用资源的前提。本试验选取42 份白萝卜自交系材料进行遗传多样性分析，确定自交系材料间遗传背景差异，为最优组配、发掘优异等位基因及标记辅助选择等提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料包括42 份白萝卜自交系（表1），主要源于韩国、日本及中国优良品种的系统选育，具有不同的叶型、根形、耐抽薹性等。FW16-3、FW16-5、FW16-12、P10、P11、P15、P21 等7 份种质为晚抽薹材料，其中P10 和P11 分别为由日本晚抽薹地方品种Tokinashi 选育的雄性不育系和保持系。田间性状鉴定于2017 年春、秋两季在北京市农林科学院蔬菜研究中心农场进行。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 的提取 取供试材料幼嫩叶片，采用改良CTAB 法提取DNA，-20 ℃贮藏备用。

1.2.2 SSR 引物与PCR 扩增 所用引物（表2）来自前期筛选的38 对核心引物（Wang et al.，2015），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体积为10 μL，包含2 μL DNA 模板（40 ng），1 μL 10× PCR buffer（含MgCl2），10 μmol·L-1SSR上下游引物各加0.2μL，0.8μLdNTPs（10 mmol·L-1），0.2 μLTaqDNA 聚合酶，5.6 μL ddH2O。反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃延伸30 s，循环35 次；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR 产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，快速银染法染色。

1.2.3 数据统计分析 先确定引物在42 份白萝卜材料中扩增的等位变异数，统计每份样品各等位变异的有无，有记为“1”，无记为“0”，建立数据库。利用如下公式计算每个SSR 位点的多态信息含量（PIC，polymorphism information content），PIC=，Pi代表扩增位点的频率，n是每个SSR位点的等位基因数。利用NTSYSpc2.2 软件进行系统聚类分析（UPGMA 法）和主成分分析（PCA）。

1.2.4 杂交组合的配制与经济性状鉴定 以雄性不育系或自交不亲和系为母本，以自交系为父本，配制34 个杂交组合。2019 年秋季对杂交组合进行经济性状测定及配合力分析，小区面积5 m2，3 次重复，每个重复取30 株测产，记为小区产量。

2 结果与分析

2.1 白萝卜亲本材料的SSR 标记多态性

38 对SSR 核心引物在基因组中的分布显示，1～9号染色体包含的引物数量分别为2、3、4、6、9、2、3、6、3 个。SSR 核心引物在42 份白萝卜亲本材料中多态性分析结果显示（表2）：共检测到43 个变异位点，其中引物RSS2841、RSS0662、RSS3615、RSS1433 和RSS3821 均包含2 个位点，扩增的等位变异数123 个，平均每个位点的等位变异数为2.86 个，变异范围为2～5 个。每个位点的多态信息含量（PIC）变幅为0.21～0.70，平均为0.52。其中引物RSS2114 在42 份白萝卜亲本材料中等位变异数最多，为5 个，PIC 值为0.68，其次为RSS0347（0.58）、RSS2188（0.70）、RSS0881（0.70）和RSS3821（位点1：0.29，位点2：0.39），均表现为较好的引物多态性和品种鉴别能力（图1）。

表2 38 对SSR 核心引物信息及在42 份白萝卜自交系中的多态性

2.2 依据SSR 标记的白萝卜亲本材料聚类分析

42 份白萝卜亲本材料的UPGMA 聚类分析结果表明（图2），遗传相似系数变异范围为0.58～1.00。其中P10 和P11 的相似系数最大，为1.00，是由于二者为具有相同的遗传背景的保持系和不育系。在遗传相似系数0.61 处，可将全部材料分为3 组。第1 组（Group1）包括7 份晚抽薹材料，其中P10、P11 来源于日本晚抽薹品种Tokinashi，其他5 份材料来源于韩国，主要表现为叶片灰绿、肉质根皮色全白、倒锥形。第2 组（Group2）包括24 份材料，来源于日本和韩国，根据主要农艺性状进一步可分为日本长圆柱青首类型（A1）、全白长圆柱加工类型（A2）、全白细长美浓类型（A3）、韩国长圆柱青首类型（A4）和韩国短圆柱青首类型（A5）等5 个亚组。第3 组（Group3）材料有11 份，主要来自中国，可分为中国南方耐热类型（B1）和中国短圆柱青首类型（B2）。利用38 对SSR 引物能够较好地体现材料间的遗传多样性和亲缘关系。

利用PCA 进一步对42 份白萝卜自交系的遗传多样性和亲缘关系进行评价（图3），结果显示PC1 和PC2 所能解释的遗传变异分别为15.7%和12.3%。42 份白萝卜自交系在第一和第二主成分排序中可分为3 组，与UPGMA 聚类分析结果基本一致。第1 组（Group1）包括5 份晚抽薹种质，值得注意的是，源于日本晚抽薹种质Tokinashi 的P10和P11 并未包含在内，可能的原因是：第1 组中的5 份晚抽薹材料不仅将Tokinashi 中的晚抽薹性状转育到韩国材料中，同时还对其他经济性状进行了改良。第2 组（Group2）包括18 份日本材料和3 份韩国材料，但UPGMA 聚类中的3 份韩国短圆柱青首类型（A5）没有包括在内，这3 份材料反而与中国萝卜距离较近，推测该类型可能具有中国青萝卜血缘。第3 组（Group3）包括11 份来自中国的材料。

2.3 不同自交系之间组配后代的主要农艺性状分析

为进一步验证材料间的亲缘关系对组配后代农艺性状的影响，以部分雄性不育系或自交不亲和系为母本，试配34 个杂交组合，并对其农艺性状进行测定（表3）。从产量上看，组间配组的杂种优势明显高于组内配组，即遗传关系较远的双亲配制的杂交组合小区产量更高。分别以位于Group1 和Group3 的材料为亲本，配制的杂交组合ZH19-4、ZH19-6、ZH19-26 和ZH19-2 的小区产量均高于35 kg；以Group2 和Group3 的材料为亲本配制的杂交组合ZH19-9，产量也超过35 kg。其中ZH19-4产量最高（40.63 kg），且该组合其他农艺性状优良，是所有组合中最优良的，命名为京研雪玉182，已经在生产上推广应用。而以组内不同材料为亲本配制的杂交组合，小区产量均低于30 kg，其中以位于Group2-A2 组内的FW16-22 和FW16-17 作为双亲配制的杂交组合ZH19-33，小区产量最低，仅为20.18 kg。

表3 不同白萝卜亲本间配组后代的农艺性状

3 讨论与结论

本试验所用的5 份晚抽薹自交系均来源于生产上主栽的韩国品种，2 份自交系P10 和P11 源于日本晚抽薹品种Tokinashi。20 世纪80 年代韩国科学家通过常规育种方法，将Tokinashi 中的晚抽薹性状转到韩国品种中，以提高韩国萝卜品种的耐抽薹性（Lee，1987）。本试验结果表明：来源于韩国的晚抽薹材料与源于Tokinashi 的P10 和P11 具有较近的亲缘关系，推测Tokinashi 是目前生产上晚抽薹主栽品种共同的晚抽薹基因来源。因此，有必要利用新的技术创制萝卜晚抽薹材料，以解决该类型材料遗传背景狭窄的问题。Curtis 等（2002）利用转基因技术将反义GI基因转到萝卜，获得了晚抽薹的萝卜新种质，为拓宽资源提供了新的途径。

亲本材料是开展育种工作的基础，长期定向的遗传改良，导致很多品种间出现较高的遗传相似性，遗传背景也逐渐变得狭窄，因此利用分子标记技术评价亲本材料的遗传多样性，分析材料间的亲缘关系，对于育种工作具有重要的指导意义。本试验选用38 对SSR 引物对不同来源的42 份白萝卜亲本材料进行遗传多样性分析并对亲本进行优势群组划分。杂交测试结果初步表明，选择不同聚类组间的亲本材料进行杂交，获得强优势组合的几率更高。因此基于分子标记技术的育种材料间的亲缘关系和遗传差异分析，能够指导育种工作者有选择地安排杂交配组，从而减少工作量、提高选择效率。