不同抗番茄黄化曲叶病毒基因对番茄褪绿病毒的耐性研究

范丽娜 高文征 李晓东 黄泽军 国艳梅 舒金帅 刘磊李君明杜永臣王孝宣*

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 陕西金鹏种业有限公司，陕西杨凌 712100）

番茄病毒病在全球普遍发生，其中番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒是两种最具破坏性的病毒，给番茄生产造成严重损失。番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）隶 属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是单链环状的DNA 病毒（Liu et al.，1998）。该病毒通过介体烟粉虱传毒，发病症状为：植株顶部叶片皱缩变小，中下部叶片黄化、变厚变硬、边缘卷曲，叶脉呈紫色；发病后期植株矮缩严重，生长减缓或停滞，新叶变小，有皱褶，无法正常开花、坐果。番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）隶属长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus），由2 条正义单链RNA（+ss RNA）组成（Wintermantel et al.，2001）。该病毒亦由烟粉虱传播，最初在我国台湾报道发生，随后在北京、江苏、山东、河北、天津、河南、陕西等地发生（Tsai et al.，2004；Zhao et al.，2013；高利利 等，2015；吴淑华 等，2016；王志荣 等，2018）。发病症状为：从植株中下部开始出现叶片脉间褪绿黄化，叶脉仍保持绿色，叶片变厚变脆、易折断；发病后期整株变黄，衰老死亡，果实无法正常彭大，产量受到严重影响。

由于TYLCV 和ToCV 的发病时间、所需环境条件和传播媒介相似，故复合侵染发生比较普遍，近年来在山东（赵黎明 等，2014）、天津（高利利等，2015）、河北（孙国珍 等，2015）、江苏（吴淑华 等，2016）、云南（刘薇 等，2018）、沈阳（赵秀香 等，2019）等省市均有报道。发生ToCV 和TYLCV 复合侵染的范围和危害程度逐渐扩大，给我国番茄病毒病的防控增加了困难。

抗TYLCV 基因的发现和抗性基因的克隆使番茄黄化曲叶病毒病得到有效防控，但目前尚未有抗ToCV 番茄品种育成的报道。在生产实践和番茄抗ToCV 育种过程中，发现含有抗TYLCV 基因的番茄材料在TYLCV 和ToCV 复合侵染时对ToCV具有一定的耐性，但不同的抗性基因以及抗性基因的不同组合对ToCV 的耐性不同。为研究不同抗TYLCV 基因对ToCV 的耐性程度，本试验利用11份携带不同抗TYLCV 基因的番茄材料，于2019年秋季在陕西杨凌通过田间烟粉虱自然接种方法进行接种鉴定，以明确单个和多个抗TYLCV 基因对ToCV 的耐性，以期为ToCV 的防治和番茄抗病育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019 年秋季在陕西杨凌进行。供试11份番茄材料及其携带抗TYLCV 基因的情况详见表1，其中Money Maker 来源于美国番茄遗传资源中心，果实中等大小，5 穗果后摘心的株高200 cm 左右，该品种不含任何抗TYLCV 基因，感病后易观察发病症状，且其基因组信息明确；其余10 份材料均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供，均为大果型番茄，单果质量200 g 左右，5 穗果后摘心的株高170 cm 左右。

表1 供试番茄材料携带抗TYLCY 基因的情况

2019 年8月20日分别将11 份番茄材料播种于无虫、无病的温室内，常规育苗。待幼苗长至五叶一心时移入栽有感染ToCV 和TYLCV 的Money Maker 植株的温室内，以烟粉虱自由繁殖方式传毒；通风口及进出口使用60 目防虫网覆盖，杜绝室外蚜虫、蓟马和烟粉虱进入。每份材料定植30 株，3次重复，随机区组排列。待目测Money Maker 植株出现感病症状后，使用70%吡虫啉水分散粒剂（艾美乐，德国拜耳集团）2 500～5 000 倍液和25%噻虫嗪水分散粒剂（阿克泰，先正达集团股份有限公司）2 000～3 000 倍液杀灭烟粉虱，每隔5～7 d 喷施1 次，连续喷施3～4 次。之后常规田间管理。11月10日，Money Maker 全部发病时，每份材料分别选择20 株进行发病情况及农艺性状调查。

克隆载体pMD18-T 购自TaKaRa 公司，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 菌株、氨苄青霉素（Amp）购自上海唯地生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自Aidlab 生物公司；反转录试剂盒5X All-In-One RT MasterMix 购自北京依联轩有限科技公司；凝胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit 由北京全式金生物科技有限公司提供；CTAB、EDTA、TRIS、PVP、巯基乙醇购自美国Amresco 公司；DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Ladder 购自天根生化科技（北京）有限公司；2X GoTaq GreenMaster Mix 由北京聚合美生物科技有限公司提供；其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。试验所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄叶片总DNA 和总RNA 的提取 在定植后和全部材料发病后，分别对感病植株上部、下部叶片进行混合取样，采用CTAB 法（Harrison et al.，1997）提取总DNA，-20 ℃保存备用；按照RNA 提取试剂盒的说明书提取总RNA，-80 ℃保存备用。同时提取健康植株叶片的总DNA 和总RNA 作为阴性对照。

1.2.2 抗性基因PCR 检测 利用TYLCV 特异性引物Ty-1、Ty-2 和Ty-3（表2）分别检测11 份番茄材料携带的抗性基因。PCR 扩增体系（20 μL）：模板DNA 2 μL，2X GoTaq Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，X ℃（表2）30 s，72℃ 1 min，循环32 次；72 ℃ 10 min。PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测并拍照。

1.2.3 番茄植株发病情况调查 参照马瑞丽（2019）的方法，对番茄褪绿病毒病进行调查、分级，计算病情指数。

分级标准：0 级，植株无症状；1 级，植株下部仅有部分叶片出现叶脉间褪绿黄化，叶片变脆变厚；2 级，植株从下部开始有50%叶片出现叶脉间褪绿黄化，叶片变脆变厚；3 级，植株大面积叶片出现叶脉间褪绿黄化，叶片变脆变厚；4 级，植株整株褪绿黄化严重，基本没有健康组织。

病情指数（DI）=∑（各级病株数×相应级数）/（调查总株数×最高级数）× 100

1.2.4 TYLCV 和ToCV 的分子鉴定 取11 份番茄材料感病植株的DNA，利用TYLCV 的特异引物TYLCV1、TYLCV2、TYLCV3（表2，这3个引物经测序拼接后能得到2 781 bp 的整个DNA-A 基因）进行PCR 扩增，方法同1.2.1。

取11 份番茄材料感病植株的RNA，参照Applied Biological Materials 公司的5X All-In-One RT Master Mix 试剂盒说明书进行cDNA 合成。具体步骤：在冰上融化RNA 样品和5X All-In-One RT Master Mix；取RNA 5 μL，5X All-In-One RT Master Mix 2 μL，Nuclease-H2O 3 μL，在冰上轻轻混匀；25 ℃ 10 min；42 ℃ 50 min；85 ℃ 5 min，立即放回冰上。将得到的cDNA 放入-20 ℃冰箱保存。ToCV 检测采用cDNA 和ToCV 的特异引物ToCVqF/R（表2）进行PCR 扩增，方法同1.2.1。

表2 试验所用引物序列及退火温度

PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。将目的谱带用凝胶回收试剂盒回收后克隆到pMD18-T，之后转化到大肠杆菌DH5α上，选取阳性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5 序列分析及进化树构建 将得到的TYLCV和ToCV 基因序列在NCBI 中进行分析比对，选取NCBI 上已登录的TYLCV 和ToCV 基因分离物，利用Mega 7.0 软件进行多序列比对及系统发育树的构建（采用邻接法neighbor-joining，NJ）。

1.2.6 番茄农艺性状调查 参照李锡香和杜永臣（2006）的方法测定株高、单株坐果数及单果质量。

2 结果与分析

2.1 番茄材料TYLCV 抗性基因分子标记分析

为了验证各材料所携带的抗性基因，利用抗TYLCV 基因检测引物对11 份番茄材料进行PCR扩增。结果表明，Money Maker 和18g-318 不含抗病基因，为感病材料；19g-883、19g-874、19g-832 的抗病基因型为Ty-1/ty-1、Ty-3/ty-3、Ty-2/ty-2，中杂302、19g-736、19g-785 基因型为Ty-1/ty-1、Ty-3/ty-3、ty-2/ty-2，172-1591、19g-700、19g-623 基因型为ty-1/ty-1、ty-3/ty-3、Ty-2/Ty-2。

2.2 番茄感病植株的ToCV 和TYLCV 鉴定

对11 份番茄材料的感病植株进行ToCV和TYLCV检测（图1），利用ToCV的特异引物ToCVqF/R 扩增出230 bp 大小的目的谱带，利用TYLCV 的特异引物TYLCV3 扩增出833 bp 大小的目的谱带，表明感病植株受到ToCV 和TYLCV 的复合侵染。

2.3 番茄植株田间发病情况调查

由图2 可见，含有TY-1/ty-1、TY-2/ty-2、TY-3/ty-3抗性基因的番茄材料19g-832、19g-883、19g-874 对ToCV 的耐性较好，病情指数低于43.5；含有TY-1/ty-1、TY-3/ty-3抗性基因的中杂302、19g-736、19g-785 对ToCV 的耐性次之，病情指数 在46.25～48.75之间；只含有TY-2/ty-2抗性基因的172-1591、19g-700、19g-623 对ToCV 的耐性稍差，病情指数大于54；而不含抗性基因的Money Maker 和18g-318 病情指数高达100.00。

番茄株高、单株坐果数、单果质量的测定结果（表3），进一步验证了同时含有TY-1/ty-1、TY-2/ty-2、TY-3/ty-3抗性基因的番茄材料生长势较好，坐果率较高，果实成熟受影响较轻；而只含有单个TY-2/ty-2抗性基因的材料株高和单株坐果数受到较大影响。

表3 11 份番茄材料的农艺性状测定结果

2.4 系统进化树的构建

将测序得到的ToCV 的CP基因序列命名为SXYL，与NCBI 上已登录的ToCV 分离物进行序列同源性分析及进化树构建。同源性分析结果表明，SXYL 与巴西分离物JQ952601.1 同源性最低，为98.6%；与国内地区分离物的同源性均达到99%以上。进一步构建系统进化树（图3），SXYL 与吉林长春分离物KU306111.1、韩国分离物KP114528.1、日本分离物AB513433.1 及分离地区较近的陕西杨凌分离物MF346383.1、山西晋中分离物KX853540.1 在同一分支上。

将测序得到的TYLCV 的DNA-A 全基因命名为TYLCV-SXYL，与NCBI 上已登录的TYLCV基因序列进行同源性分析及进化树构建。同源性分析结果表明，TYLCV-SXYL 与伊朗分离物AJ132711.1 同源性最低，为94%；与国内地区分离物的同源性达到98%以上。进一步构建系统进化树（图4），TYLCV-SXYL 与北京分离物GU983859.1、山东寿光分离物KJ546418.1、辽宁建平分离物KJ754190.1 在同一分支上，且与国内其他地区的分离物在同一大分支上。

3 讨论与结论

病毒的复合侵染在田间栽培中经常发生，在多个国家报道中发现番茄发生ToCV 时常与其他病毒病共同发病，与ToCV 发生复合侵染的病毒有番茄严重皱纹病毒（Tomato severe rugose virus，ToSRV）（Macedo et al.，2014）、凤果花叶病毒（Pepino mosaic virus，PepMV）（Davino et al.，2008）、番茄灼烧病毒（Tomato torrado virus，ToTV）（Gómez et al.，2010）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）（García-Cano et al.，2006）等。在上述报道中发现，复合感染病毒的番茄植株发病症状比仅由单一病毒感染的发病症状严重，但目前关于其发病机理方面还没有深入的研究。本试验中，感染ToCV 和TYLCV 后，番茄植株顶部叶片出现皱缩，边缘卷曲，叶片变厚变硬，表现出明显的TYLCV 症状；植株下部叶片出现脉间褪绿黄化，但叶脉保持绿色，叶片变厚易折断，表现出明显的ToCV 症状；植株发病症状比单一的病毒感染严重且植株生长、坐果受到严重影响。

目前尚未有关于抗ToCV 的番茄栽培品种育成的报道，但在育种过程中发现含有抗TYLCV基因的番茄材料ToCV 发病较轻。本试验利用11份携带不同抗TYLCV 基因的番茄材料，探究不同Ty抗性基因对ToCV 的耐性，结果表明含有抗TYLCV基因的番茄材料均对ToCV有一定的耐性，尤其同时含有TY-1/ty-1、TY-2/ty-2、TY-3/ty-3抗性基因的番茄材料在受到TYLCV 和ToCV 共同侵染时，ToCV 病情指数较低，且植株的生长势、坐果能力、果实成熟度等受影响程度较轻。同时对ToCV 的CP基因和TYLCV 的DNA-A 全基因进行克隆和序列分析，结果表明复合侵染时的ToCV的CP基因核苷酸序列与国内分离物同源性均达到99%以上；TYLCV 的DNA-A 基因核苷酸序列与国内分离物同源性均在98%以上。表明复合侵染时TYLCV 和ToCV 没有产生新的病毒菌株。虽然目前关于ToCV 与TYLCV 复合侵染的机制还不是很清楚，但病毒的复合侵染已给蔬菜生产造成了巨大的经济损失，针对ToCV 与TYLCV 共同侵染在农业生产中应引起足够的重视。